序列优化的小鼠IL-33基因在哺乳动物细胞中的有效分泌表达

论文摘要

目的:白细胞介素（IL）-33具有重要的免疫调控作用,在疾病中扮演着重要的角色。本文旨在通过基因优化实现IL-33在哺乳动物细胞中的高效表达,为疾病机理研究以及疫苗免疫佐剂应用等提供基础。方法:根据小鼠白细胞介素-33成熟肽（m IL-33）的氨基酸序列,以哺乳动物细胞基因表达密码子偏好性进行基因优化设计;化学合成优化的m IL-33基因片段,通过搭桥PCR将编码人CD8α信号肽的核酸序列分别与优化或未优化的m IL-33基因连接,并与绿色荧光蛋白（EGFP）基因分别构建到双表达单元质粒p Bud CE4. 1的不同启动子下;重组质粒经lipofectamine 3000和PEI转染293FT细胞;以Western blot和ELISA检测重组蛋白的表达;收集表达的m IL-33刺激巨噬细胞Raw264. 7,ELISA检测培养上清的TNFα水平,以证明IL-33的生物学活性。结果:重组质粒经酶切鉴定及测序分析证实构建成功; lipofectamine 3000转染效率较PEI转染更高; Western blot和ELISA结果显示密码子优化的m IL-33表达水平较未优化序列更高,在EF-1α启动子和CMV启动子指导下m IL-33在293FT细胞表达水平相当,CD8α信号肽成功引导m IL-33的分泌,产物具生物学活性。结论:密码子优化操作显著改善了m IL-33在哺乳动物细胞中的表达水平,为进一步研究奠定了基础。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1 质粒、菌株及细胞系
•   1.2 主要试剂
•   1.3 IL-33不同基因序列与引物的设计
•   1.4 CD8α+m IL-33及EGFP基因的扩增
•   1.5 表达m IL-33和EGFP的重组质粒的构建及鉴定
•   1.6 重组质粒转染293FT细胞
•   1.7 重组蛋白表达的分析鉴定
•     1.7.1 Western blot
•     1.7.2 ELISA
•   1.8 m IL-33的生物活性检测
• 2 结果
•   2.1 编码m IL-33蛋白的基因优化
•   2.2 重组表达质粒鉴定
•   2.3 重组表达质粒转染293FT细胞的结果
•   2.4 表达产物的鉴定
•   2.5 IL-33的生物学活性检测
• 3 讨论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 高福兰,齐家龙,舒聪妍,谢航航,黄惟巍,刘存宝,杨旭,孙文佳,白红妹,马雁冰

关键词: 序列优化,白细胞介素成熟肽

来源: 中国生物工程杂志 2019年03期

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 昆明医科大学,中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南省重大传染病疫苗工程技术研究中心

基金: 国家自然科学基金面上项目(81773270),云南省应用基础研究重点项目(2016FA049)资助

分类号: Q78

DOI: 10.13523/j.cb.20190307

页码: 46-55

总页数: 10

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