一种硬脑膜生物补片及其制备方法论文和设计-韩韦红

全文摘要

本发明属于生物补片领域，涉及一种硬脑膜生物补片及其制备方法。本发明的硬脑膜生物补片原料，不是来自商品肉畜，而是来自种畜，如经产母猪SIS补片，其具有天然良好力学性能；本发明的方法在去细胞环节采用植物源试剂，使用这类天然温和试剂对ECM天然结构基无损伤，且能保留更多有效活性成份，具有更好的诱导组织修复生长能力；本发明的方法，既没有用交联剂来增强力学性能，也没有用合成去污剂来去细胞；避免了化学试剂残留及其毒性，同时能够保留更多ECM中有效成份，特别是GAGs的含量。本发明的硬膜生物补片不仅质地柔软且韧性好，易于缝合紧密，能防止脑脊液渗漏；而且降解速度与新硬膜生长基本同步，更有利于硬膜的修复再生。

主设计要求

1.一种用于硬脑膜修复的生物补片，其特征在于，所述补片，含有去细胞的种畜结缔组织，其中种畜是针对商品肉畜而言的，特指成年的，能繁育的，饲养时间至少一年以上，不包括年轻的后备种畜。

设计方案

2.根据权利要求1所述的补片，其特征在于，所述去细胞的去细胞试剂主要由皂素组成。

3.根据权利要求1所述的补片，其特征在于，所述种畜为经产的母猪、母牛、母羊、母马。

4.根据权利要求1所述的补片，其特征在于，所述种畜为健康的淘汰母猪。

5.根据权利要求1所述的补片，其特征在于，所述结缔组织是指小肠粘膜下层、膀胱粘膜下层、胃粘膜下层、真皮基质、心包膜、脑膜、羊膜、脏器膜、腹膜的一种或多种组合。

6.根据权利要求1所述的补片，其特征在于，所述种畜结缔组织指经产母猪小肠粘膜下层。

7.一种硬脑膜生物补片的制备方法，其特征在于，去细胞工艺中去细胞试剂主要由植物源非离子表面活性剂组成。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述去细胞试剂，是植物源五环三萜烯皂素、类固醇皂素之一或其组合物。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述去细胞试剂，是Quil-A、茶皂素之一或其组合物。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述去细胞试剂的有效工作浓度重量比为0.05-1%，与补片原料作用时间为每次10-60分钟，作用温度为4-15℃。

11.根据权利要求7-10所述的任一项方法，其特征在于，所述硬脑膜生物补片的制备方法，原料主要由种畜结缔组织组成。

设计说明书

技术领域

本发明涉及组织修复用生物材料领域，具体涉及一种硬脑膜生物补片及其制备方法。

背景技术

硬脑膜，也称硬膜，是保护脑组织的一道重要屏障，对于维护神经系统的结构及功能活动意义重大；硬脑膜是一厚而坚韧的双层膜。外层是颅骨内面的骨膜，仅疏松地附于颅盖，特别是在枕部与颞部附着更疏松，称为骨膜层。但在颅的缝和颅底则附着更牢固，很难分离。颅内无硬膜内腔。硬脑膜内层较外层厚而坚韧，与硬脊膜在枕骨大孔处续连，称为脑膜层;主要作用是保护大脑；创伤或颅脑手术可造成硬脑膜缺损，需要通过手术，采用硬膜补片来修补硬脑膜，封闭硬脑膜下腔，这样可明显减少或预防脑脊液漏、颅内感染等并发症。

理想硬脑膜补片应具备下列条件：①具有安全性，无毒性，无感染性，②组织相容性好，无免疫排斥反应。③致密性好，无渗透性，能防止脑脊液漏，保护脑组织。④具有韧性，易牢固缝合。⑤能促使硬脑膜再生，不发生粘连。⑥使用方便，手术简单，易于消毒灭菌。⑦取材广泛，价格低廉。⑧具有稳定的生物学惰性的，不引起急慢性炎症反应。

目前应用较多的硬脑膜修补材料主要是异种去细胞基质，这类天然生物补片，也称为去细胞组织补片，补片初始原料主要来源于动物小肠粘膜下层、膀胱粘膜下层、胃粘膜下层、心包膜、脑膜、羊膜、脏器膜、腹膜及真皮等组织；通过一系列加工处理，包含重要工艺，如去细胞、去DNA，去α-Gal抗原等免疫原成分。这种方法获得的去细胞基质材料，一方面能够保留三维立体结构，同时也含有一些重要活性成份。由去细胞基质制备而成的理想生物补片，应具有良好的生物适应性，可降解性、可吸收性；力学强度适宜性，无毒性，无免疫性；能够为宿主细胞的趋化、附着、增殖、分化提供理想的空间支架和适宜的微（营养）环境，有利于靶组织的结构修复和功能重建。

关于补片的力学性能，临床上多使用源自商品肉畜的心包、腹膜或胸膜、肌腱、小肠系膜等作为硬膜生物补片的最初原料。实际应用中，这类补片在力学性能上常达不到硬膜补片的力学要求；因此在制备硬膜补片过程中，常采用以下二种方法来增强补片力学性能，达到韧性好、拉伸强度高的要求。

一是：化学（生化）方法，在补片制备过程中，使用环氧化物或戊二醛等化学交联剂，以提高补片的生物力学特性。如申请人是北京桀亚莱福生物技术有限责任公司、发明人是孙继煌的公开号为CN108261565的专利，和发明人是刘博文的公开号为CN105999411的专利，这两篇专利在去（脱）细胞工艺上有所优化，同时为了达到补片在力学上的要求，都使用了交联剂。其缺点是交联程度很难控制，残留的交联剂有潜在的细胞毒性，且这类交联型补片通常力学性能好，抵抗力强，不易降解或降解缓慢，降解与组织再生不能同步匹配，易导致纤维化、慢性炎症等不良反应；广东某公司的硬脑膜补片，采用心包膜或胸膜经环氧交联处理等加工而成，补片力学强度够，但降解较慢，可导致纤维化、慢性炎症反应、存在与颅骨或脑组织粘连等风险；且因其较硬，无法与脑组织表面完美贴合。

二是：物理方法，如将单层片横向或纵向，多层交叉部分重叠放置，如申请人为上海宏创医疗科技有限公司，发明人是周宁辉，公开号为CN106039404A的专利，虽然整体上采用此方法制备成的补片，其拉伸强度有所提高，但使用补片原料较多，一方面是原料被浪费，另一方面是补片过厚，会使整个补片完全降解的时间被拖得过长，进而影响靶组织的修复和功能的康复。另外本申请人公开的专利CN109248339A文献，其创新点是将补片原料制成细条状后捻成线，再通过编织的方式制成补片；经过编织而制成的补片，其拉抻强度得到明显提高，但是此步骤需要先将补片原料制成细条，再通过编织方式制备，技术上有点难度，步骤上有点复杂。

另外目前市场上，有北京某公司、美国某公司的硬膜补片产品，采用的是牛腱提取胶原而制成的，特点是生物相容性好，且无需缝合；但其降解速度过快，在新组织组织未长成之前,硬膜补片已过早降解了。

关于补片中的有效活性成份，因不同的去细胞方式（机械法、化学法、酶法）以及使用不同的去细胞试剂，在补片中保留的有效活性成份差异很大；Thomas W. Gilbert et al在杂志《Biomaterials》27(2006)第3677中表1对不同去细胞方法和去细胞试剂做了详细比较。除了有酶、酸碱之外，还会用去污剂（也称表面活性剂）作为去细胞试剂，现作简要介绍如下：

1.Triton X-100，-200，化学名称聚乙二醇辛基苯基醚，是一种化工合成的去污剂；

2.SDS，化学名称十二烷基硫酸钠，一种常用的离子型去垢剂，HLB为40，属于亲水基表面活性剂；可使细胞膜崩解，但其能与膜蛋白疏水部分结合，并使其与膜分离，但SDS低浓度会限制组织中对细胞的去除效率；较高浓度的SDS可破坏蛋白质中的离子键和氢键等非共价键，造成对组织ECM三维多孔结构的破坏及对蛋白质类成份构象的损伤；

3.CHAPS中文名为[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐，其主要是作为蛋白质裂解液,用于增溶膜蛋白和裂解蛋白-蛋白之间的相互作用；

4.甜菜碱型表面活性剂（Betaine type surfactant 或Sulfobetaine）是由季铵盐型阳离子部分和羧酸盐型阴离子部分所构成；常见例子为烷基（硫代）甜菜碱，代表性产物是N-十烷基-N，N-二甲基-N-羧甲基甜菜碱(BS-10)，对天然状态膜蛋白具有增溶作用。

上述去污剂都是化工合成或半合成的，去污力强，去细胞效果好；但是易导致ECM中有效成份如GAGs的流失，以及对ECM天然立体结构破坏。采用这类去细胞试剂制备的生物补片，其保留的有效活性成份少，ECM立体结构损伤大，因此其诱导组织再生能力差。

发明内容

本发明的目的在于，针对现有硬膜生物补片在力学强度上较弱，不能有效满足临床实际需要；以及现有硬膜增强补片力学强度的方法，存在前述种种不足和缺陷；发明人围绕补片生物力学这一特定技术特征，通过大量文献阅读，结合自身对学术理论的仔细分析，以及多年丰富的工作经验，将理论与实践密切结合，出人意料但又在情理之中，巧妙又方便地解决了常见硬脑膜补片力学性能不足的技术难题。

为了实现本发明的目的，一方面本发明提供一种用于硬脑膜修复的生物补片，其特征在于，所述补片，含有去细胞的种畜结缔组织；

进一步的，所述去细胞的去细胞试剂主要由皂素组成；

进一步的，所述种畜为经产的母猪、母牛、母羊、母马；

进一步的，所述种畜为健康的淘汰母猪；

进一步的，所述结缔组织是指小肠粘膜下层、膀胱粘膜下层、胃粘膜下层、真皮基质、心包膜、脑膜、羊膜、脏器膜、腹膜的一种或多种组合；

进一步的，所述种畜结缔组织指经产母猪小肠粘膜下层；

另一方面本发明提供一种硬脑膜生物补片的制备方法，其特征在于，去细胞工艺中去细胞试剂主要由植物源非离子表面活性剂组成；

进一步的，所述去细胞试剂，是植物源五环三萜烯皂素、类固醇皂素之一或其组合物；

进一步的，所述去细胞试剂，是Quil-A、茶皂素之一或其组合物；

进一步的，所述去细胞试剂的有效工作浓度重量比为0.05-1%，与补片原料作用时间为每次10-60分钟，作用温度为4-15℃；

进一步的，所述硬脑膜生物补片的制备方法，原料主要由种畜结缔组织组成。

现有动物源硬脑膜补片是取自新鲜屠宰动物，经去细胞工艺等步骤加工而成，所使用的新鲜屠宰动物组织，都是刚出栏的商品化肉猪、肉羊、肉牛；例如屠猪场里待宰的，绝大多数都是刚出栏的商品化肉猪，品种以外三元杂交品种为主；出栏肉猪体重在90—120公斤；饲养日龄为5—6个月。

发明人解决硬脑膜补片力学性能不足的技术问题，发明人采用了与现有技术完全不同的技术思路，既不是停留在加工补片时物理方法的细微改进，如采用何种方式重叠（纵\/横\/斜），重叠比是多少，需要重叠几层，编织时使用的原料线粗细，是平纹织、斜纹织还是拧织等方式，也不是停留在交联剂的品种选择、配比、浓度改进，交联时间长短等技术参数的优化；而是从制备去细胞生物补片的第一步即原料的源头抓起，从最初的动物源出发，以此为技术突破点或着力点来进行深入研究，本发明产品的主要创新点，就在于去细胞补片的动物组织原料的选择，不是现在大家使用的商品级肉畜，而是选用种畜，优选经产母畜，最优选的是因繁殖性能有所下降而健康淘汰母猪；发明人在深入养猪第一线，在与大型养猪场负责人充分沟通后，根据其讲述的养殖模式（通常都是自繁自养）和养殖周期（肉猪5--6个月出栏，体重约90—120公斤；而母猪在八到十胎之后，因繁殖性能下降而渐渐淘汰，此时饲养已有36（三年）个多月的实际情况，发明人通过分析比较检测源自母猪SIS和肉猪SIS所制备的两种补片的力学性能差异，发现用母猪源SIS补片，其拉伸强度（即韧性）要比商品肉猪源SIS补片要明显地高许多；同时源自淘汰母猪SIS补片又要比胎次少的经产母猪SIS补片的韧性（拉伸强度）要好；综合比较，优选价格低廉的淘汰母猪作为补片原料。

本发明产品的次要创新点在于优选组织部位是猪小肠粘膜下层（SIS），次选才是猪心包或腹膜，最次选是猪真皮、猪膀胱；这类组织去细胞而制成的补片，都含有天然立体的三维结构，但与其他组织部位比较而言，猪小肠粘膜下层（SIS）的成份构成以I型纤维胶原蛋白为主，同时还含有III、IV、VI型胶原蛋白，特别是其中含有重要的IV型胶原蛋白，对新血管和基膜的形成具有明显的促进作用；另外依据美国STEPHEN F. BADYLAK博士发表的多篇文章表明SIS补片的降解产物具有较强的抗菌活性，有类似于猪防御素（porcinedefensin, pBD-1）的功能；以及George S.Hussey 2018年的文章《Extracellular MatrixBioscaffolds for Building Gastrointestinal Tissue》报道SIS补片降解产物还具有诱导细胞趋化和有丝分裂的作用。

本发明的方法是，使用植物源非离子表面活性剂来去细胞这一关键步骤来实现的；同时去细胞的组织，是来自种畜的结缔组织；方法的主要创新点在于，在制备硬膜补片过程中，使用了一种植物源去细胞试剂，这类天然的非离子型表面活性剂（如植物源天然皂素、庚基葡萄糖苷），能有效地去除组织中的细胞；这种去细胞的方式针对性很强，主要是通过破坏脂质细胞膜和细胞器的膜，去细胞效果不仅彻底，而且作用方式温和，既不对ECM结构有明显损伤，也不会引起ECM中有效活性成份（如糖胺聚糖等）的明显流失；能保留ECM中更多的有效活性成份，包括细胞生长因子，糖胺聚糖等，更有利于诱导细胞趋化、生长和组织修复再生；在低温条件下去细胞即破坏细胞，可以大大减少并减缓，因细胞破碎后释放出来的内源酶可能会产生的对ECM所产生的一些降解、破坏作用。

所述植物源去细胞试剂皂素（Saponin）是某些植物中发现的一类次级代谢产物，因在水溶液中振荡时产生肥皂样泡沫而闻名；一个皂素分子结构中，同时含有亲水基团和亲油基团；亲水基团为一或多个亲水糖链，亲油基团也称为亲脂母核，母核可以分为两类即三萜类(triterpene)或类固醇类（甾体类）。商业化的皂素产品有来自南美洲树种QuillajaSaponariaMolina和墨西哥植物MohaveYucca(也称Yuccaschidigera)的树皮中分离出来的，中国本土的皂素产品来自无患子、油科植物。第一个优选的皂素是QuillajaSaponariaMolina植物精取物，也称为Quil-A，CAS号8047-15-2，其临界胶束浓度（CMC, Critical micelle concentration）>0.03%，可从多种商业化渠道购得，包括Sigma公司，BerghausenCorporation，SergeantChemical公司(Clifton，NJ)，Superfosa\/s(Vedbaek，Denmark)，以及BrenntagBiosector(Frederikssund，Denmark)；Quil-A理化特性可参见Superfos的题为PurifiedSaponinAdjuvantQuil-A的商业出版物；另一个优选的皂素是油茶皂素，简称茶皂素（Tea Saponin），又名茶皂甙，是一种性能良好的天然表面活性剂，90%以上茶皂素（HPLC级纯度）容易制备和获得，如金德国的发明专利，申请号为CN201610990197，名称是：一种高纯茶皂素的生产方法;在本发明中皂素做为去细胞试剂时的用量，以纯皂素（saponin）为有效成分来计算，去细胞的工作浓度为0.05%--1%，优选0.25—0.5%。

另外由于皂素作用的方式是温和的，可能存在与细胞膜脂质结合的部分可逆性；若后续的冲洗液或浸泡液因皂素含量低或无皂素，则可能会使去细胞及其碎片效果降低；所以去细胞后的下一步洗液或泡液中也需要使用含有皂素的溶液；可选择原浓度的皂素溶液进行是可洗或浸泡，以利更彻底地去除细胞及其细胞碎片。

发明原理：

本发明的补片产品，其补片原料来源是种畜，如已产过几胎的母猪，饲养时长通常超过24个月；正常母猪每年产2--2.3胎，母猪妊娠期平均是114天,空怀期为10--15天,哺乳天数为21—28天；淘汰母猪主要是因为繁殖性能下降，如产仔数少，产弱仔多，难配种或者奶水少，断奶窝重轻等因素，通常淘汰母猪，其饲养月龄达到40个月以上；相对于商品肉猪而言，经产母猪各方面的组织和器官发育都很完全，在亚器官水平和结构、介观和微观性能、组织学强度等指标上实现了真正意义上，充分且全面地成熟；进一步从分子水平和分子结构上来讲，可能胶原蛋白羟基化程度高，三螺旋结构稳定性更好，胶原间天然交联度高，热稳定性较好；在宏观上表现为结缔组织的力学性能较好，制备成的补片，检测出来的拉伸强度高。而现在补片原料的来源都是，商品肉畜如肉猪，其通常饲养周期短，只有5-6个月时间，其出栏体重90—120公斤，相对于经产母猪（包括淘汰母猪180--200公斤）的体重和大小而言，商品肉猪的体重是明显偏轻的，其体积是偏小的；而且商品肉猪在屠宰出栏时，其饲养时长只有5---6个月，而经产母猪的饲养时长达至少在12个月以上（按只生了一胎仔窝计算），淘汰母猪则会达到40个月；饲养时长是商品肉猪的2到8倍；同时商品肉猪的各组织器官，相对经产母猪而言，只是表面初具规模，框架结构成形，但实际上其内部结构、微观性能、组织学强度等指标，并没有真正彻底地充分且全面地成熟，进一步从分子水平和分子结构上来讲，可能胶原蛋白羟基化程度低，三螺旋结构稳定性差，胶原间天然交联度低，热稳定性较差；在宏观上表现为结缔组织的力学性能较差，制备成的补片，检测出来的拉伸强度低。

本发明的方法中，去细胞试剂选用植物源非离子型表面活性剂，优选植物源皂素，这类试剂去细胞的方式针对性强，主要是通过破坏脂质细胞膜和细胞器膜，作用方式针对性强，对ECM结构无损伤，不会引起ECM中有效成份（如糖胺聚糖）的流失；相比于其他化工类或半合成类去污剂而言，都是去细胞效果彻底，但植物源皂素作用方式独特且温和，使用这类植物源皂素去细胞，能保留更多ECM中有效成份；如采用本发明方法制备的补片，与化工类去污剂去细胞制备的补片相比，其补片中糖胺聚糖（GAGs）含量要明显高；糖胺聚糖(Glycosaminoglycans，GAGs)的糖链结构具有很高的复杂性和时空特异性，是糖链合成相关酶在不同细胞组织和器官的不同发育阶段不同的表达调控方式和水平所致，糖胺聚糖结构的复杂性赋予其功能的多样性和适应性。

与现有技术相比，本发明具有以下显著优点和有益效果：

1.本发明的硬脑膜补片产品，以种畜组织为原料，而不是源自商品肉畜，有更好的天然交联度，补片韧性好、拉伸强度高、不易破裂，能防止脑脊液渗漏。

2.本发明的硬脑膜补片产品，以小肠粘膜下层为原料，保留了细胞外基质中立体三维结构、各类功能蛋白、生长因子以及糖胺聚糖等成分，具有良好诱导组织再生功能，能加快术后硬膜组织的生长和功能的重建。

3.本发明的产品，没有交联剂和合成类去污剂残留，不会具有潜在细胞毒性，不会导致纤维化、慢性炎症。

4.本发明的硬脑膜补片产品，其ECM三维结构具诱导细胞和血管长入功能，在新组织长入的同时自身会逐渐降解，降解产物多肽成分具有抗菌性能，可降低植入后炎症和感染的发生。

5.本发明的方法中，使用植物源非离子型表面活性剂作为去细胞试剂，替代化工类去污剂，不会导致ECM中有效成份大量流失。

另外从经济学上来讲，原料可以是因繁殖性能下降而被淘汰的经产母猪，通常这类原料价格要明显低于商品肉猪；对于今后大批量采购原料来说，使用淘汰母猪作为结缔组织去细胞的原料，可以为企业节省大笔的开支，这也是创新点之一。

本发明的目的在于，提供一种硬脑膜补片及其制备方法，为达到实现本发明的目的，具体是通过以下技术方案来实现的。

所述去细胞硬脑膜补片，其动物组织原料是源自成年种畜，而不是源自商品肉畜。

进一步的，所述成年种畜包括种猪、种牛、种羊、种马等。

进一步的，优选成年种畜为经产的母猪、母牛、母羊、母马等。

进一步的，优选成年种畜为因繁殖性能下降而被淘汰的母猪、母牛、母羊、母马等。

进一步的，所述去细胞硬脑膜补片的原料包括小肠粘膜下层、膀胱粘膜下层、胃粘膜下层、真皮基质、心包膜、脑膜、羊膜、脏器膜、腹膜的一种或多种原料的组合。

进一步的，优选的动物组织原料为淘汰母猪的小肠粘膜下层。

进一步的，所述去细胞硬脑膜补片是经清洗、消毒、脱脂、去细胞、去DNA和去α-Gal抗原、定型、冻干灭菌而成。

本发明还提供了一种硬脑膜补片的制备方法，包括：

1)取材和洗净：取种畜的结缔组织，充分洗净；

2)预处理：机械刮除其中的非结缔组织，并扔弃；将靶组织冲洗干净，置于弱酸溶液中浸泡，得到预处理待用补片原料；

3)预消毒：用含有过氧乙酸和乙醇的混合溶液，在超声及室温条件下，浸泡补片原料，进行消毒；再用纯化水超声清洗；

4)去脂：使用乙醇溶液，在超声、常温条件下浸泡补片原料，之后用注射用水超声清洗；

5)去细胞：用含植物源表面活性剂溶液，在低温和超声下浸泡补片原料；接着用新的同浓度植物源表面活性剂溶液对补片原料进行浸泡; 补片原料与溶液的比例为1:10（W\/V）；再用PBS-EDTA超声清洗补片原料，补片原料与溶液的比例为1:10（W\/V）；按实际情况可重复去细胞1-3次；

6)去DNA和去α-Gal抗原：含DNA酶的水溶液浸泡补片原料，浸泡温度为36℃，浸泡时间为15--40分钟；清洗后再用含α-半乳糖苷酶溶液，浸泡补片原料，时间为15--40分钟；

7)使用10mM NaOH水溶液，常温、超声条件下，浸泡补片原料；再用PBS超声清洗直至中性；

8)将半成品补片制成片状，重叠固定于模具上，冷冻干燥，包装、辐照灭菌可得硬膜补片。

进一步具体操作方法是：

1.取材和洗净：取种畜的小肠，充分洗净；

2.预处理：机械刮除除去小肠的粘膜层、肌层、浆膜层、淋巴结，分离出粘膜下层；将小肠粘膜下层冲洗干净，置于醋酸溶液中浸泡，浸泡时间30--120分钟，小肠粘膜下层与醋酸溶液的比例为1:5--1:10；得到预处理待用补片原料；

3.预消毒：用含有过氧乙酸和乙醇的混合溶液，在超声及室温条件下，浸泡补片原料，进行消毒；过氧乙酸浓度为0.5-1.5％，乙醇浓度为15-25％，补片原料与混合水溶液的比例为1:5--1：10，浸泡时间为30--120分钟；再用纯化水超声清洗；

4.去脂：使用乙醇溶液，在超声、常温条件下浸泡补片原料，乙醇浓度为90-100%，补片原料与乙醇比例为1:5--1:10，常温浸泡时间为0.5--6h；之后使用注射用水超声清洗；

5.去细胞：使用含植物源皂素溶液，在4-15℃和超声下浸泡补片原料10—60分钟；补片原料与溶液的比例为1:10（W\/V）；之后用同浓度新鲜皂素溶液对补片原料浸泡5--60分钟；接着用PBS-EDTA进行浸泡10--60分钟；重复去细胞1-3次；

6.去DNA和去α-Gal抗原：含DNA酶的水溶液浸泡补片原料，浸泡温度为36℃，浸泡时间为15--40分钟；清洗后再用含α-半乳糖苷酶的水溶液，浸泡补片原料，浸泡时间为15--40分钟；

7.使用10mM NaOH水溶液，常温、超声条件下，浸泡补片原料；再用PBS超声清洗直至中性；

8.将半成品补片制成片状，交叉重叠固定于模具上，冷冻干燥，包装、辐照灭菌可得硬膜补片。

进一步的，在去细胞工艺（步骤5）中，优选以下技术参数：

皂素溶液中有效皂素的含量为0.05---1%（W\/W），补片原料与植物源皂素溶液的比例为1:5---1:10，在超声条件下，于低温4—10℃条件下浸泡20--45分钟；然后用同浓度的新鲜皂素溶液对再补片原料浸泡5--30分钟；接着用PBS-EDTA进行浸泡10--30分钟；重复去细胞1次。

进一步的，在去细胞工艺（步骤4）中，更优选，以下技术参数：

皂素溶液中有效皂素的含量为0.25--0.5%（W\/W），补片原料与植物源皂素溶液的比例为1:10，在超声条件下，于低温4℃条件下浸泡20分钟；

进一步的，植物源表面活性剂是指植物源三萜烯皂素、类固醇皂素之一或其组合物；

进一步的，植物源三萜烯皂素是Quil-A来源、茶皂素之一或其组合物；

进一步的，皂素的工作浓度为0.25--0.5%（W\/W），注意，不是按商品来计算有效工作浓度。

进一步的，皂素溶液去细胞所需要浸泡作用时间为20--30分钟；作用温度都是4°C。

中英文术语\/名词首选按下列文字说明来理解，另有详细说明的除非；其他术语按本领域普通技术人员水平来理解其含义。

中英文术语名词解释：

1.组织修复材料、组织再生材料、生物补片、生物修补片、生物支架、可降解补片、可吸收补片Bio-Mesh、Bio-Patch、Patch、Bioscaffold，这些个中英文名词或术语，表面上虽有不同，但其目的和用途基本是一样的；除非有特殊的具体说明，否则上述几个名词的内涵，在实质上是等同的。

2.小肠粘膜下层SIS（Small Intestinal Submucosa)，小肠组织包括空肠和回肠部分，在除去小肠粘膜层、肌层、浆膜层后所剩余的部分，以胶原蛋白为主要成份，约占80%以上。

3.细胞外基质ECM（Extracellular Matrix）：是存在于所有组织和器官中的非细胞成分，其不仅对细胞组织提供必需的物理支撑，为各种细胞的正常生理活动，提供适宜的场所及微环境；而且对组织的形态发生、细胞的趋化和分化，以及重要的生理生化和生物力学等方面，起到重要的杠杆调节作用，从而影响或调控组织和器官的功能。细胞50%的功能是由细胞外基质所营造的外部微环境所决定的。

4.细胞外基质的物质组成：是以结构蛋白，如胶原蛋白（Collagen）、弹性蛋白(elastins)、纤丝蛋白等大分子成份为主要框架结构，并附着了一些功能蛋白如纤连蛋白FN(fibronectins)、层连蛋白LN (laminins)等；同时其中还携带有各类细胞生长因子(如成纤维细胞因子FGF、转化生长因子TGF、血管内皮生长因子VEGF；可能也含有极少量但很重要的表皮生长因子EGF和胰岛素样生长因子-1(IGF-1)另外细胞外基质中还含有糖胺聚糖（GAGs）类、蛋白聚糖等活性成分。

5.糖胺聚糖GAGs（Glycosaminoglycan），也称粘多糖，为杂多糖的一种，主要存在于动物结缔组织中，是参与组织及软组织组织等正常生理活动的重要原料；按单糖残基、残基间连键的类型以及硫酸基的数目和位置，糖胺聚糖可分为5个主要类别，透明质酸（HA)、硫酸软骨素(CS)、硫酸皮肤素(DS)、硫酸角质素(KS)、硫酸乙酰肝素和肝素(HP)。

6.去细胞基质ACTM（Acellular Tissue Matrix）或无细胞组织基质：是指采用特定的试剂和处理方式，将动物器官或组织中的细胞、病毒、DNA等会产生免疫排斥反应的成分充分地去除或灭活，最大限度地保留原有天然立体结构的完整性，以及尽量保留原有基质中的细胞生长因子和活性功能成份；脱细胞基质由于其天然立体三维（3-D）结构、含有生物活性因子、能够被受体降解、易诱导受体干细胞移（易）位分化等特点，被广泛应用于临床中，用于组织的修复和再生（先天缺损和后天创伤）；脱细胞基质是新型的组织再生修复材料，具有良好的生物支架性能。

7. 种畜：是针对商品肉畜而言的；饲养的主要目的是用来繁育幼畜的，而不是作为商品肉畜来短期饲养的；饲养商品肉畜主要目的是用于长肉，以供人食用，以提供动物源蛋白质；本专利中的种畜，包括猪、牛、羊、马、驴、驼、犬；所述种畜都是成年的，能繁能育的，通常饲养时间至少一年以上；例如种猪包括母猪和公猪，这里的母猪就是指能繁殖的成年母猪，不包括年轻的后备母猪。

8. 经产母畜：属于种畜的一部分，是至少生过一胎的母畜；是相对于后备母畜而言的，后备母畜主要是指因为年龄或月龄还没有到，还没有怀过孕的的年轻母畜。

9. 淘汰母畜：本属于种畜的一部分；在养殖场里，管理者考虑到，当母畜繁殖性能下降到一定程度，如产仔数少，泌乳量低，断奶窝重轻，以及综合考虑母畜栏的利用率、淘汰母猪的价格等多种因素；从经济学角度来判断分析，认为继续饲养该母畜所获得的价值已显著降低，淘汰这类母畜会更加划算；每个养殖场对淘汰母畜的评判标准存在一定的差异；例如通常母猪在分娩8胎之后会渐渐地被淘汰；不同品种的猪之间略有差异。

除非上下文有清楚的说明，本说明书和所附权利要求中用到的单数形式“一个和“该”包括复数含义。因此，例如，“该方法”包括一或多种方法，和\/或步骤，它们属于本文所述类型和\/或是本领域技术人员阅读了本文后很明显能认识到的。术语“约”或“接近”是指统计学意义上的范围值，范围可以是在一个数量级之内，通常在指定数值或范围的50％以内，进一步指在20％以内，还更通常在10％以内，甚至更通常在5％以内。术语“约”或“接近”所涵盖的能允许的变化取决于研究的具体体系，是本领域技术人员可以很容易地认识到的。

下面结合具体实施例，以进一步描述本发明的原理和方案；应当理解，这些实施例只是为了举例说明和方便理解本发明的思想，但不能局限于此；实施例并非以任何方式来限制本发明范围，以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

具体实施方式

实施例1（经产母猪 24个月 + 0.25%Saponin）

猪小肠粘膜下层硬脑膜补片的制备，具体步骤如下：

1)取材并洗净：预处理：根据饲养记录，选取饲养天数达24个月左右，处于空怀阶段的二元杂经产母猪，屠宰后取其新鲜小肠组织清洗洁净；

2)预处理：使用物理刮除法除去猪小肠的粘膜层、肌层、浆膜层、淋巴结，分离出粘膜下层，置于0.5%醋酸溶液浸泡30分钟，猪小肠与醋酸溶液的比例为1:5，再使用纯化水浸泡3 遍，得到生物补片原料，即小肠粘膜下层，下述简称为SIS材料；

3)消毒：使用含有1.0％过氧乙酸和15％乙醇的混合水溶液，SIS材料与混合水溶液的比例为1:10，超声条件下，室温浸泡100分钟，进行消毒。之后使用纯化水超声清洗3遍；

4)脱脂：使用浓度为90%的乙醇，SIS材料与乙醇的比例为1:10，超声条件下，常温浸泡2h；之后使用注射用水超声清洗3遍；

5)去细胞：使用含0.25%皂素的溶液（源自Quil-A，以纯皂素的含量来计算工作浓度），在4℃和超声条件下浸泡补片原料30分钟；之后用同样浓度0.5%皂素溶液对补片原料进行冲洗10分钟；接着再用PBS-EDTA溶液对补片浸泡20分钟；重复前述去细胞步骤一次，总共计时120分钟左右；

6)去DNA和去α-Gal抗原：使用含5U\/ml DNA 酶的水溶液，SIS材料与DNA酶溶液的比例为1:5，超声条件下，于37℃条件下浸泡20分钟；之后使用PBS冲洗3遍；使用含5U\/ml α-半乳糖苷酶的水溶液，SIS材料与α-半乳糖苷酶溶液的比例为1:5，超声条件下，于30℃条件下浸泡20分钟；之后使用PBS溶液冲洗；

7)使用浓度为10mM 的NaOH水溶液，SIS材料与NaOH溶液的比例为1:20，超声条件下，常温浸泡50分钟；之后使用PBS超声清洗直至中性；

8)定型、冻干、灭菌：将去细胞后的片状原料，四片间纵横交叉，重叠固定于模具上，冷冻干燥后，包装，最后进行辐照灭菌。

实施例2（淘汰母猪+0.25% Saponin）

小肠组织的预处理，消毒、脱脂、去细胞、去DNA和去α-Gal抗原、冻干、灭菌等步骤，完全同实施例一；区别只是在最初的动物选择上有所区别，在屠宰场，选取淘汰母猪的新鲜小肠作为补片原料；经深入了解，淘汰的二元杂母猪通常的胎龄在8胎以上，体重180公斤左右，都是空怀的；经追溯调查了解，淘汰母猪饲养时长已超过40个月。

实施例3（出栏商品肉猪+ 0.25% Saponin）

小肠组织的预处理，消毒、脱脂、去细胞、去DNA和去α-Gal抗原、冻干、灭菌等步骤，完全同实施例一；区别只是在最初的动物选择上有所区别；选取屠宰场里，体重100公斤左右的杜长大三元杂商品肉猪的新鲜小肠组织，清洗干净；经了解其饲养天数达160-180天。

实施例4（出栏商品肉猪+0.25% SDS ）

动物选取、结缔组织的预处理，消毒、脱脂、去细胞、去DNA和去α-Gal抗原、冻干、灭菌等步骤，完全同实施例三；区别只是在第四步去细胞试剂的选择上，本实施例选用0.25%SDS取代实施例三中的0.25% 皂素。

实施例5（经产母猪+ 0.5% 茶皂素）

动物选取、结缔组织预处理，消毒、脱脂、去细胞、去DNA和去α-Gal抗原、冻干、灭菌等步骤，完全同实施例一；区别只是在第四步去细胞试剂的选择上，本实施例选用0.5% 茶皂素取代实施例一0.25% 皂素。

实施例6（淘汰母猪+ 0.5% 茶皂素）

动物选取、结缔组织预处理，消毒、脱脂、去细胞、去DNA和去α-Gal抗原、冻干、灭菌等步骤，完全同实施例二；区别只是在第四步去细胞试剂的选择上，本实施例选用0.5% 茶皂素,替代实施例一0.25%皂素。

实施例7：硬脑膜补片光学观察及有效成份检测。

光学显微镜观察：

方法：用福尔马林固定，石蜡包埋，将实施例中的补片切成薄片，经二甲苯脱蜡、酒精脱水，苏木精—伊红染色，显微镜下观察细胞残留情况和基质纤维结构。

结果：六个实施例中所有的去细胞补片，都没有观察到细胞及其碎片残留；能看到胶原纤维连续，粗细不一，但均无明显地断裂。

糖胺聚糖（GAGs）定量检测的方法有Dubious法、Carbazole法、Elson-Morgan法、ELISA和电泳法。

对1-6个实施例制备得到的补片样品，采用商业化ELISA法试剂盒对重要活性成份糖胺聚糖（GAGs）的含量进行检测；预处理方式是采用低温研磨法对各类补片进行处理，结果如下表1：

实施例8：硬脑膜补片的力学性能检测。

对实施例1---6制备得到的硬脑膜补片样品进行拉伸强度的检测。

方法：将样品沿两个方向分别裁剪为宽度为10mm形状；裁剪后在相对湿度40%-60%、温度22±2℃环境内放置2小时后进行试验。夹具间距为25mm，将试样两端固定在拉伸试验机的夹头上，以100mm\/分钟的速度拉伸，记录断裂时的最大力值。

结果见下表2：

本领域中普通技术人员可根据上述说明，对本发明做出多种简单的变化或调整或组合；因而，在不违反本发明的权利要求宗旨的前提下，实施例中的某些细节，不应构成对本发明的限定，本发明将以所附权利要求书界定的范围作为保护范围。

设计图

一种硬脑膜生物补片及其制备方法论文和设计

一种硬脑膜生物补片及其制备方法论文和设计-韩韦红

全文摘要

主设计要求

设计方案

设计说明书

设计图

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