论文摘要
沙门菌（Salmonellaenterica）多重耐药现象日益严重,通过体外人工诱导的方式获得稳定的单一药物耐药菌株是研究其耐药机制的重要手段。近年来研究表明,双组分系统（Two-component system,TCS）与细菌耐药性关系密切。因此,本研究以鼠伤寒沙门菌体外诱导环丙沙星耐药株CR为研究对象,利用自杀质粒pLP12介导的同源重组方法,以氯霉素抗性标记和阿拉伯糖诱导的致死基因vmt进行正、反向双重筛选,构建鼠伤寒沙门菌双组分系统baeSR基因缺失株CR△baeSR;构建回补表达质粒pBAD33-Cm-rp4-baeSR,将其转化于缺失株,获得回补株CR C△baeSR。对CR△baeSR及CR C△baeSR进行遗传稳定性检测,并测定CR、CR△baeSR及CR C△baeSR的生长曲线,采用微量肉汤稀释法测定13种常见药物对三株菌的最小抑菌浓度（MIC）,并对其生物膜形成能力及运动性进行分析。在蛋白质组学层面采用串联质谱标签（Tandem mass tag,TMT）技术筛选试验菌株的差异表达蛋白,挑选靶蛋白利用平行反应监测（Parallel reaction monitoring,PRM）技术进行验证,以探讨双组分系统BaeSR与鼠伤寒沙门菌耐药性之间的关系。主要研究内容与结果如下:1.原始株、缺失株、回补株生物学特性检测。对试验菌株进行生长曲线、药物敏感性、生物膜形成能力及运动性的测定,结果显示,与原始株相比,缺失株生长速率未出现显著差异（P>0.05）;缺失株对环丙沙星（CIP）、沙拉沙星（SAR）、恩诺沙星（ENR）、庆大霉素（GEN）、阿米卡星（AMK）、安普霉素（APR）、四环素（TET）、多西环素（DOX）的耐药值均下降2倍,对头孢噻呋（CEF）耐药值下降4倍;缺失株生物膜形成能力（P<0.01）及运动性（P<0.05）均显著下降,baeSR基因回补后相关能力有所回升,表明双组分系统BaeSR可通过对鼠伤寒沙门菌生物膜形成能力及运动性的调控进而影响其对抗菌药物的敏感性。2.原始株、缺失株、回补株TMT定量蛋白质组学分析。三株菌中共鉴定到2422个蛋白质,其中2184个包含定量信息,以1.3倍为变化阈值（Fold change>1.3或≤0.76）,P<0.05为标准筛选差异表达蛋白,并对其进行生物信息学分析。结果显示,CR△baeSR/CR 比较组中共筛选到186个差异蛋白（上调68个,下调118个）,CR C△baeSR/CR比较组中共筛选到562个差异蛋白（上调227个,下调335个）。与微生物、氨基酸、碳、硫、嘧啶代谢等相关的代谢通路显著富集,表明baeSR基因的缺失可导致多种代谢途径发生变化,从而影响相关蛋白的表达。3.差异表达蛋白的筛选及PRM靶向蛋白验证。根据原始株、缺失株、回补株之间差异表达蛋白的注释信息,共筛选到了 19个与耐药相关的蛋白发生差异表达,主要包括外膜蛋白、ABC转运蛋白、鞭毛蛋白、生物膜形成相关蛋白等,表明鼠伤寒沙门菌baeSR基因的缺失可影响其他耐药相关蛋白的表达。对定量到的蛋白进行分类统计,共筛选出17个TCS相关蛋白,表明双组分系统BaeSR与其他TCS之间可能存在相互调控的关系,进而影响鼠伤寒沙门菌的耐药性。挑选其中9个耐药相关蛋白进行PRM靶向验证,结果与TMT分析结果趋势一致,证实了 TMT定量蛋白质组学结果的可靠性。本研究通过构建鼠伤寒沙门菌baeSR基因缺失株及回补株,确定其遗传稳定性后分别从耐药表型（抗菌药物敏感性、生物膜形成能力、运动性）及蛋白质组学等方面探讨baeSR基因缺失对其耐药性的影响,为深入研究TCS与细菌耐药性之间的关系提供理论依据。
论文目录
文章来源
类型: 硕士论文
作者: 王文静
导师: 李琳
关键词: 鼠伤寒沙门菌,双组分系统,耐药性,基因敲除,蛋白质组学
来源: 安徽农业大学
年度: 2019
分类: 基础科学,农业科技
专业: 生物学,畜牧与动物医学
单位: 安徽农业大学
基金: 国家自然科学基金(31772802)
分类号: S852.61
DOI: 10.26919/d.cnki.gannu.2019.000261
总页数: 61
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