粪肠球菌源EndoE的重组表达及酶学性质研究

论文摘要

内切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（Endo-β-N-acetylglucosaminidase, ENGase, EC3.2.1.96）是糖蛋白去糖基化重要的工具酶,其可以切割糖蛋白上N-连接的聚糖。本研究基于粪肠球菌（Enterococcus faecalis）基因组数据,通过PCR扩增ENGase基因endoE （endoglycosidase E）,并以同源重组方式构建表达载体pET-28a-endoE,实现了EndoE在大肠杆菌（Escherichia coli） BL21 Star （DE3）中的高效表达,并对EndoE去糖化的催化特性等进行了较为系统的分析。研究结果显示,重组EndoE在大肠杆菌中以可溶形式表达,经钴离子螯合层析与阴离子交换层析可获得高纯度的目标蛋白,产量为45.6 mg/L。去糖基化活性分析表明,重组EndoE能去除天然及变性核糖核苷酸酶B （ribonuclease B, RNase B）、鸡卵白蛋白（ovalbumin, Ova）和免疫球蛋白G （immune globulin G, IgG） N-连接的糖基侧链。基质辅助激光解吸/电离串联飞行时间质谱证实了EndoE对RNase B N-连接糖链的水解活性。Endo E在20～50℃和pH 4.0～6.0的范围内均具有良好的水解活性,并对100 mmol/L二硫苏糖醇（DL-dithiothreitol, DTT）、1 mol/L NaCl和2%Triton X-100具有耐受性。EndoE较已报道的粪肠球菌来源的ENGase具有更为广泛的底物作用范围,是蛋白质糖基化分析中有潜在应用价值的工具酶。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1 菌种和试剂
•   1.2 生物信息学分析
•   1.3 endoE基因克隆
•   1.4 pET-28a-endoE原核表达载体构建
•   1.5 重组EndoE的表达与纯化
•   1.6 活性分析
•   1.7 重组EndoE的热稳定性及pH稳定性分析
•   1.8 盐离子、还原剂与表面活性剂对重组EndoE活性的影响
•   1.9 MALDI-TOF-MS质谱鉴定EndoE去糖基化后的RNase B
• 2 结果与分析
•   2.1 endoE基因的克隆与序列分析
•   2.2 EndoE的重组表达分析
•   2.3 重组EndoE的分离纯化
•   2.4 重组EndoE的去糖基化活性分析
•   2.5 重组EndoE的酶学性质分析
•   2.6 盐离子、还原剂与表面活性剂对重组EndoE活性的影响
•   2.7 MALDI-TOF-MS鉴定去糖基化RNase B
• 3 讨论
• 4 结论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 韩小韦,黄云娜,牛毅男,李学俊,徐全乐,陈鹏

关键词: 内切乙酰氨基葡萄糖苷酶,糖基化,重组表达,酶学性质

来源: 农业生物技术学报 2019年06期

年度: 2019

分类: 农业科技,基础科学

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 西北农林科技大学生命科学学院,广州市从化区从化中学

基金: 国家自然科学基金(No.30400282和No.31171606),陕西省重点研发计划(No.2017NY-033)

分类号: S852.61

页码: 1118-1125

总页数: 8

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