改造人白细胞介素2基因序列并在大肠杆菌中做表达验证

论文摘要

论文主要研究了两个方面的内容。一是对人白细胞介素2基因序列进行了改造和优化。首先将人白细胞介素2基因编码序列（CDS）改造成大肠杆菌的高表达模式,选用了大肠杆菌高表达基因的核糖体结合位点（Shine-Dalgarno sequence,简称SD）序列,作为对比还选用了大肠杆菌低表达基因的SD序列。然后组装成“高表达SD+改造后CDS”和“高表达SD+改造前CDS”基因对照组;“高表达SD+改造后CDS”和“低表达SD+改造后CDS”基因对照组。前者主要考察改造CDS对基因表达的影响,后者主要检验SD序列的优化选择对基因表达的影响。二是将组装的两组基因序列在大肠杆菌TOP10中克隆及表达,通过实验来验证改造和优化后人白细胞介素2基因（hIL-2）表达水平的理论预测。理论推测改造后的hIL-2基因编码序列在大肠杆菌中的表达水平为CAI=0.884,原hIL-2基因编码序列在大肠杆菌中的表达水平为CAI=0.267。为了保证编码基因表达的正常启动,选取大肠杆菌rplL高表达基因的启动子区和终止子区来代替hIL-2基因的启动子区和终止子区。其中高表达SD序列选用该基因的SD序列,低表达SD序列选用了前期研究给出的低表达基因的SD序列来替代rplL基因的SD序列。通过重组表达载体pBV220/hIL-2进行基因表达。实验上首先通过SDS-PAGE跑胶定性,之后利用ELISA分别对经过3h、4h、5h 42℃诱导后的表达蛋白定量检测。结果显示:（1）在“高表达SD+改造后CDS”和“高表达SD+改造前CDS”基因对照组中,CDS改造后的蛋白表达量极显著的高于CDS改造前的蛋白表达量,且蛋白表达量提高了131.41%,实验结果与理论预测吻合,这说明基因经过改造编码区后的蛋白表达量比原基因的蛋白表达量有明显的提高。（2）在“高表达SD+改造后CDS”和“低表达SD+改造后CDS”基因对照组中,高表达SD序列所对应基因的蛋白表达量显著高于低表达SD序列所对应基因的蛋白表达量,蛋白表达量提高了36.55%,表明高表达SD序列本身会提高基因的表达水平。实验结果验证了我们的理论预测。总之,通过改造基因编码序列和优化基因启动区域中的SD序列均会显著提高外源基因在宿主细胞中的蛋白表达水平。本文的研究方法对于提高转基因效率具有重要的参考价值。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
•   1.1 白介素2的研究进展
•   1.2 白介素2的分子特性
•   1.3 白介素2的医学应用
•   1.4 大肠杆菌研究背景
•     1.4.1 大肠杆菌简介
•     1.4.2 大肠杆菌作为表达宿主细胞的优劣及其应用
•   1.5 大肠杆菌信号肽
•   1.6 研究的目的及意义
• 第二章 人白介素2基因的改造和优化
•   2.1 大肠杆菌编码序列与基因表达的关系
•   2.2 人白介素2基因的序列设计
•     2.2.1 人白介素2蛋白的氨基酸序列
•     2.2.2 人白介素2基因编码序列的改造方法
•   2.3 人白介素2基因中SD序列的选取
•   2.4 完整mRNA序列的构建
• 第三章 人白介素2基因的克隆
•   3.1 实验材料
•     3.1.1 克隆载体、菌株及序列合成
•     3.1.2 工具酶和试剂盒
•     3.1.3 主要仪器设备
•     3.1.4 试剂与培养基
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 引物的设计
•     3.2.2 PCR反应体系如下
•     3.2.3 WIL和GIL基因的PCR产物回收及克隆
•     3.2.4 HSD和LSD的PCR产物回收及克隆
•     3.2.5 克隆载体与目的基因连接
• 第四章 人白介素2基因在大肠杆菌中的表达
•   4.1 目的基因的扩增
•   4.2 重组表达载体pBV220/hIL2的构建
•     4.2.1 重组表达载体的构建
•     4.2.2 目的基因WIL和GIL在大肠杆菌中的表达
•     4.2.3 目的基因HSD和LSD在大肠杆菌中表达
•   4.3 重组人白介素2基因的诱导表达
•     4.3.1 目的蛋白的SDS-PAGE定性检测
•     4.3.2 诱导时间对人白介素2基因表达的影响
•   4.4 实验结果与分析
•     4.4.1 SDS-PAGE电泳结果
•     4.4.2 诱导时间对人白介素2基因表达量的影响
•     4.4.3 人白介素2基因表达蛋白的ELISA检测及统计分析
•   4.5 结果分析
• 第五章 总结与展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 李瑞瑞

导师: 李宏

关键词: 人白细胞介素基因,基因改造和优化,大肠杆菌,高效表达,实验验证

来源: 内蒙古大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 内蒙古大学

分类号: Q78

总页数: 63

文件大小: 3354K

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