褐藻胶裂解酶的克隆表达和酶学性质研究及发酵条件优化

论文摘要

本文证明了恶臭假单胞菌可以产褐藻胶裂解酶,首先筛选并合成了恶臭假单胞菌Pseudomonas putida KT2440中褐藻胶裂解酶基因（alginate lyase,Aly）,基因大小为1116 bp,编码372个氨基酸。通过对比筛选出了NdeⅠ与EcoRⅠ为酶切位点进行双酶切,将酶切后目的基因连接到同样双酶切的pET-28a（+）克隆载体上,构建pET-28a（+）-Aly重组质粒,导入BL21里构建异源表达系统,经1 mM的IPTG诱导后,可高效表达目的蛋白。在酶学性质方面,实验表明该褐藻胶裂解酶反应的最适pH值为7.5,最适温度为45℃,最适NaCl浓度为0.5 M,底物专一性实验证明该褐藻胶裂解酶为偏好poly M的双功能酶。利用Design Expert软件中Box-Behnken实验设计的原理,作三因素三水平的响应面分析试验,实验结果表明,当反应在温度为47℃、pH为8.0、NaCl浓度为0.6 M的条件下进行时,可得最大酶活力231 U/mL,比酶活力为189.3 U/mg,在目前报道的褐藻胶裂解酶的比活力中处于较高的水平。根据测得的酶学条件为基础,研究重组菌的发酵条件,通过单因素试验,找到对发酵所得总酶活有显著影响的因素为葡萄糖浓度、接种量、初始pH以及IPTG浓度。根据Box-Behnken实验设计的原理,作四因素三水平的响应面分析试验,结合RSM给出的优化结果,对实验进行修改,结果表明其他因素均在最适的条件下,当发酵的葡萄糖添加量为10 g/L、接种量为1.3%、初始pH为8.2、IPTG诱导浓度为1 mM时,可得最大发酵总酶活为225 U/mL。酶解产物经过TLC验证主要为二糖,可判断该褐藻胶裂解酶为内切酶;酶解产物的抑菌实验表明该褐藻胶裂解酶酶解产物对大肠杆菌、乳酸菌及枯草芽孢杆菌都有一定的抑制作用,与过氧化氢降解法所得的褐藻寡糖相比,抑菌作用还有待提高;抗氧化性实验表明,该褐藻胶裂解酶酶解产物具有清除自由基的的能力,在清除DPPH自由基实验中,该酶酶解产生的褐藻寡糖IC50为0.46mg/ml。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 英文缩写词表
• 文献综述
•   1 褐藻胶
•     1.1 褐藻胶简介
•     1.2 褐藻胶的理化性质
•     1.3 褐藻胶及其衍生物的应用
•   2 褐藻寡糖
•     2.1 褐藻寡糖简介
•     2.2 褐藻寡糖制备
•     2.3 褐藻寡糖的应用
•   3 褐藻胶裂解酶
•     3.1 褐藻胶裂解酶简介
•     3.2 褐藻胶裂解酶的来源及研究进展
•     3.3 褐藻胶裂解酶的分类
•     3.4 酶活检测方法
• 1 引言
•   1.1 选题意义
•   1.2 研究目的
•   1.3 主要技术路线
• 2 材料与方法
•   2.1 材料
•     2.1.1 菌株来源
•     2.1.2 实验主要试剂及仪器
•     2.1.3 实验主要试剂的配置
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 目的基因的合成及扩增
•     2.2.2 感受态细胞的制备
•     2.2.3 重组质粒的构建
•     2.2.4 重组褐藻胶裂解酶的诱导表达及纯化
•     2.2.5 蛋白结构预测
•     2.2.6 蛋白及葡萄糖标准曲线的测定
•     2.2.7 褐藻胶裂解酶的酶学性质
•     2.2.8 响应面法优化褐藻胶裂解酶的酶促反应
•     2.2.9 重组大肠杆菌表达褐藻胶裂解酶培养条件的初步研究
•     2.2.10 响应面法优化褐藻胶裂解酶的发酵实验
•     2.2.11 酶解产物分析及简单应用
• 3 实验结果与分析
•   3.1 目的基因合成与扩增
•   3.2 工程菌BL21（DE3）-Aly的构建
•   3.3 Aly基因的测序
•   3.4 重组菌BL21（DE3）-pET28a（+）-Aly的诱导表达
•   3.5 重组菌BL21（DE3）-pET28a（+）-Aly的纯化
•   3.6 蛋白结构预测
•   3.7 蛋白标准曲线与葡萄糖标准曲线
•   3.8 褐藻胶裂解酶的酶学性质
•     3.8.1 重组褐藻胶裂解酶的比活力
•     3.8.2 pH对酶活力及稳定性的影响
•     3.8.3 最适温度及热稳定性探究
•     3.8.4 NaCl浓度对酶活力的影响
•     3.8.5 金属离子对酶活力的影响
•     3.8.6 底物专一性实验
•   3.9 响应面法探究褐藻胶裂解酶的酶学性质
•   3.10 重组大肠杆菌表达褐藻胶裂解酶培养条件的初步研究
•     3.10.1 生长曲线的测定
•     3.10.2 重组菌培养基条件的优化
•     3.10.3 培养环境条件的优化
•     3.10.4 诱导条件的优化
•   3.11 响应面法探究褐藻胶裂解酶发酵条件
•   3.12 酶解产物分析及简单应用
•     3.12.1 酶解产物分析
•     3.12.2 褐藻寡糖抑菌实验
•     3.12.3 褐藻寡糖抗氧化性研究
• 4 讨论
•   4.1 褐藻胶裂解酶理化性质
•   4.2 褐藻胶裂解酶的酶活
•   4.3 褐藻胶裂解酶产物
•   4.4 褐藻胶裂解酶的展望
• 5 结论
• 参考文献
• 作者简介

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 寻翠欢

导师: 薛挺

关键词: 褐藻胶裂解酶,基因克隆,酶学性质,发酵优化,产物应用

来源: 安徽农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 安徽农业大学

分类号: Q946.5

DOI: 10.26919/d.cnki.gannu.2019.000497

总页数: 82

文件大小: 5512K

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