催化RNA切割反应的新型短结合臂脱氧核酶

论文摘要

核酸是生命必需的生物大分子,在生命体中除了行使存储和传递遗传信息的功能之外,在遗传信息的表达过程中也起到了重要的调控作用。20世纪80年代以前,生物酶的概念普遍与蛋白质联系在一起。自从Sidney Altman和Thomas Robert Cech实验室发现细胞内存在具有催化功能的RNA之后,生物酶的范围由蛋白质扩展至包括核酸。除了天然的生物酶之外,科学家可在实验室利用分子进化的手段产生人工蛋白酶和核酸酶,这些人工酶在生物医药领域发挥了重要的作用。脱氧核酶是一类具有催化活性的单链DNA分子,其通过折叠形成特定的三维结构可以催化多种化学反应,例如RNA切割、RNA连接和DNA切割等。其中,切割RNA的脱氧核酶通过Watson-Crick碱基互补配对与靶标RNA序列靶向结合,催化RNA在特定位置发生断裂,在生物传感器及基因治疗领域得到了重视和迅速的发展。在众多不同催化活性的核酸酶中,8-17是一种研究透彻、应用广泛的催化RNA切割反应的脱氧核酶。然而,8-17具有一定的底物序列偏好性,难以催化某些RNA底物发生位点特异性切割反应（例如UU连接处）,因此通过体外筛选手段鉴定新的催化RNA切割反应的脱氧核酶具有重要意义。在这里,我们报告了一种新的脱氧核酶,称为10-12opt,具有异常短的底物结合臂。该脱氧核酶含有14个碱基组成的催化核心,其优先催化底物在5’-UN-3,二核苷酸处的切割（对于UU切割,kobs=0.9h-1）。其左结合臂仅含有三个碱基并只与RNA底物形成两个经典碱基配对。突变分析表明,切割位点下游+4位置的鸟嘌呤碱基参与催化,该碱基不与脱氧核酶形成经典的碱基配对,才能达到最佳的催化效果。进一步研究表明该碱基6号位的羰基可能直接参与脱氧核酶的催化反应。对10-12opt进行功能性表征发现其催化RNA底物切割依赖于金属离子的浓度和pH,在pH为7.5,镁离子浓度为50mM时,切割速率为0.015min-1。通过对RNA底物切割位点下游的碱基进行单位点突变分析,我们发现,脱氧核酶10-12opt特异性识别并切割含有UNGAG序列的RNA底物。于是我们选择了三条含此共有序列、但切割位点不同的microRNA作为底物进行了体外切割反应,结果发现10-12opt可以催化所有microRNA底物发生位点特异性切割反应,而8-17仅能催化其中一条发生反应。此外,我们将10-12opt的RNA底物与ATP的DNA适配体连接以构建ATP分子生物传感器。实验结果表明,传感器信号随ATP浓度升高而逐渐增强。综上所述,这些结果表明10-12opt是一种新型的、不同于8-17的、催化RNA切割反应的脱氧核酶序列,其底物序列选择性与现有的脱氧核酶可有效互补,可催化某些RNA分子在UU连接处发生位点特异性切割反应。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
•   1.SELEX技术的基本原理
•   2.脱氧核酶及其功能
•   3.两种普适性的脱氧核酶及其应用
•   4.本课题的研究目标和内容
•   参考文献
• 第二章 催化RNA切割反应的脱氧核酶的体外筛选
•   1.引言
•   2.实验材料
•     2.1 核酸,蛋白酶和感受态细胞
•     2.2 实验试剂及耗材
•     2.3 实验仪器
•   3.实验方法
•     3.1 催化RNA切割反应的脱氧核酶的体外筛选方案
•     3.2 10-12opt切割产物的鉴定
•   4.结果与讨论
•     4.1 催化RNA切割反应的脱氧核酶的体外筛选流程
•     4.2 活性脱氧核酶的挑选,命名及其底物切割位点的鉴定
•     4.3 对10-12结合臂的初步优化
•     4.4 对10-12催化环的优化
•     4.5 10-12opt与8-17同源性分析
•     4.6 利用质谱对10-12opt的切割产物进行分析
•   参考文献
• 第三章 10-12OPT的生物化学参数表征
•   1.引言
•   2.实验材料
•     2.1 核酸,蛋白酶
•     2.2 实验试剂及耗材
•     2.3 实验仪器
•   3.实验方法
•     3.1 10-12opt保守碱基及非经典碱基对上的基团保守性分析
•     3.2 10-12opt对底物切割位点选择性分析
•     3.3 FRET分析镁离子诱导的10-12opt与底物复合物的空间折叠
•     3.4 10-12opt对二价金属离子的依赖性及pH依赖性分析
•     3.5 10-12opt的动力学测定
•   4.结果与讨论
•     4.1 10-12opt左侧结合臂及催化环的保守碱基分析
•     4.2 10-12opt左侧结合臂非经典碱基对的深入研究
•     4.3 10-12opt对底物切割位点的碱基选择性分析
•     4.4 10-12opt 7号位T与切割位点碱基相互作用分析
•     4.5 10-12opt的结合臂长度对催化活性的影响
•     4.6 缩短的10-12opt左侧结合臂上非经典碱基对特异性分析
•     4.7 荧光共振能量转移分析镁离子诱导的10-12opt与底物的构象
•     4.8 10-12opt的金属离子依赖性分析
•     4.9 10-12opt的pH依赖性分析
•     4.10 10-12opt的酶切反应动力学分析
•   参考文献
• 第四章 10-12OPT在切割MICRORNA及ATP传感器中的应用
•   1.引言
•   2.实验材料
•     2.1 核酸
•     2.2 实验试剂及耗材
•     2.3 实验仪器
•   3.实验方法
•     3.1 10-12opt对不同切割位点的microRNA序列的体外剪切
•     3.2 10-12opt参与构建的ATP传感器对靶标的特异性检测
•   4.结果与讨论
•     4.1 10-12opt能切割位点不同的microRNA序列
•     4.2 10-12opt参与构建的ATP传感器能对ATP分子实现特异性检测
•   参考文献
• 结论
• 讨论
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王月瑶

导师: 于涵洋,李尔广

关键词: 体外筛选,脱氧核酶,剪切

来源: 南京大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 南京大学

分类号: Q752

总页数: 68

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