烟草NtGCN2的原核表达纯化、抗体制备及性质鉴定

论文摘要

面对干旱、冷害、盐渍等不良环境,植物通常会调节自身代谢以应对胁迫,维持自身生长,而蛋白质作为生命的物质基础在这种调节中起到了至关重要的作用。GCN2是真核翻译起始因子eIF2α激酶,可以使eIF2α发生磷酸化,从而对蛋白质合成进行调节。酵母和动物中的研究发现,GCN2参与了多种胁迫应答的调节。在植物中,目前研究发现仅有一个eIF2α激酶--GCN2,推测其在植物应对胁迫的代谢通路中起到了重要作用,然而目前有关植物GCN2的研究仍存在许多未知之谜。目前有关植物GCN2的异源表达、纯化、性质鉴定和抗体制备等研究相对较少,一定程度上制约了植物GCN2的进一步研究。因此,本研究在前期研究基础上克隆了烟草NtGCN2（GenBank登录号:KJ706220）的N端1-437aa基因序列,构建了重组质粒pCzn1-NtGCN2（1-437aa）,并在大肠杆菌E.coli BL21（DE3）-Plys中成功表达了 NtGCN2（1-437aa）蛋白。其次,通过包涵体复性和Ni2+-NTA柱层析方法获得了纯化的NtGCN2（1437aa）蛋白质。再次,利用获得纯化蛋白质免疫新西兰大白兔后制备了NtGCN2多克隆抗体,并进行了 western-blot检测。此外,利用纯化的重组蛋白,采用同位素标记的方法对NtGCN2性质进行了体外鉴定。最后,根据酵母双杂交、Co-IP和RNA-seq等研究结果,采用实时荧光定量PCR对NtGCN2的互作蛋白进行了验证。这些结果为进一步研究植物GCN2的功能及其在逆境胁迫应答中的作用奠定了基础。研究的主要结果如下:首先,基于NtGCN2的全长序列的结构域分析,根据N端的（1-437aa）序列设计引物从前期构建的pMD-NtGCN2载体上克隆了 N端（1-437aa）片段,将该片段插入pCzn1载体中,获得了重组质粒pCzn1-NtGCN2（1-437aa）。将该载体转化至大肠杆菌BL21（DE3）Plys中,采用0.5mM的IPTG于37℃下诱导表达4小时,SDS-PAGE检测发现目的蛋白NtGCN2（1-437aa）主要存在于沉淀中。另外,在前期研究中,本研究组对NtGCN2的全长蛋白也进行了原核表达表达,SDS-PAGE检测发现目的蛋白主要存在于大肠杆菌BL21-（DE3）-RIPL的全蛋白上清液中。其次,通过包涵体复性和Ni2+-NTA琼脂糖亲和层析柱对表达的蛋白质进行了纯化,获得了条带单一的NtGCN2（1-437aa）和NtGCN2全长蛋白。将获得的蛋白免疫新西兰白兔后获得了 NtGCN2多克隆抗体。ELISA结果显示制备的两种抗体效价均为1:520 000。Western-blot检测结果发现制备的NtGCN2（1-437aa）和NtGCN2抗体均可成功检测到重组NtGCN2的表达,然而未能检测到烟草中NtGCN2的表达。我们推测其原因可能是原核表达系统缺乏甲基化、糖基化和其他修饰过程,导致抗原结合位点不能正常呈现而造成的。再次,利用实验室前期制备的NtGCN2（激酶功能域）和NteIF2α纯蛋白,采用同位素标记法对NtGCN2的激酶活性进行了体外鉴定。结果发现NtGCN2可以使其底物NteIF2α发生磷酸化,并且NteIF2α磷酸化水平随着反应体系中NtGCN2浓度增加而增加。时间梯度研究结果表明,NteIF2α的磷酸化水平随着反应时间的延长而增加。该研究结果说明重组蛋白NtGCN2可以在体外使eIF2α磷酸化,表明NtGCN2具有激酶活性。最后,我们根据实验室前期进行的酵母双杂交、Co-IP和RNA-seq数据筛选了 NtGCN2可能的互作蛋白,采用实时荧光定量PCR对NtGCN2互作蛋白进行了验证。结果发现,真核翻译起始因子eIF2α,离子转运相关基因HIPP和光呼吸相关基因PHAO的表达量随着NtGCN2表达量的增加而增加,而mRNA稳定性相关基因CCR4的表达量随着NtGCN2表达量的增加略有下降,活性氧相关基因NQO1的表达量无明显变化。该结果表明NtGCN2可能参与了活性氧清除和光呼吸等代谢过程。此外,在干旱处理下,NtGCN2,eIF2α,HIPP和NQO1基因的表达水平显著增高,其中PHAO的表达量增加约6倍,CCR4表达量的下降程度也表现的更为明显。该研究结果同时也表明,NtGCN2,eIF2α,HIPP,NQO1和CCR4等可能协同参与了植物干旱胁迫的调节。推测NtGCN2可能通过调节植物体内的蛋白质合成、mRNA含量、离子传递效率和氧化还原状态等参与了烟草对干旱胁迫应答,这些研究为梳理植物GCN2参与的胁迫调节网络奠定了基础。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 1. 文献综述
•   1.1 eIF2α激酶参与的蛋白翻译调控机制
•     1.1.1 eIF2参与的蛋白质翻译调控
•     1.1.2 eIF2α激酶组成及功能
•   1.2 GCN2介导的胁迫应答机制
•     1.2.1 GCN2的结构
•     1.2.2 GCN2的功能
•       1.2.2.1 酵母GCN2介导的胁迫应答
•       1.2.2.2 动物GCN2介导的胁迫应答
•       1.2.2.3 植物GCN2介导的胁迫应答
•   1.3 GCN2抗体制备和性质鉴定现状
• 2 引言
•   2.1 研究目的与意义
•   2.2 研究内容
•   2.3 研究的创新点
• 3 材料与方法
•   3.1 实验材料
•     3.1.1 载体、菌株和试剂
•     3.1.2 实验仪器与设备
•     3.1.3 植物材料
•     3.1.4 常用试剂及培养基配制
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 构建原核表达载体pCzn1-NtGCN2（1-437aa）
•       3.2.1.1 NtGCN2（1-437aa）基因的引物设计
•       3.2.1.2 NtGCN2（1-437aa）序列的扩增
•       3.2.1.3 PCR产物纯化
•       3.2.1.4 重组载体的连接
•       3.2.1.5 大肠杆菌的转化
•       3.2.1.6 菌落的PCR验证
•       3.2.1.7 质粒的提取
•       3.2.1.8 重组质粒的酶切鉴定
•       3.2.1.9 重组质粒的DNA测序
•     3.2.2 原核表达
•       3.2.2.1 将pCzn1-GCN2（1-437aa）载体转化大肠杆菌BL21（DE3） Plys
•       3.2.2.2 重组蛋白表达
•     3.2.3 原核表达蛋白的提取
•     3.2.4 蛋白纯化
•       3.2.4.1 包涵体蛋白复性
• 2+-NTA琼脂糖柱纯化蛋白'>      3.2.4.2 Ni²⁺-NTA琼脂糖柱纯化蛋白
•     3.2.5 SDS-PAGE分析及Western blot检测
•       3.2.5.1 SDS-PAGE分析
•       3.2.5.2 Western blot
•     3.2.6 抗体制备及效价检测
•       3.2.6.1 抗体制备及纯化
•       3.2.6.2 抗体效价检测
•     3.2.7 NtGCN2激酶活性鉴定
•       3.2.7.1 NtGCN2的浓度梯度酶活鉴定
•       3.2.7.2 NtGCN2的时间梯度酶活鉴定
•     3.2.8 实时定量荧光PCR
•       3.2.8.1 烟草样品的处理
•       3.2.8.2 烟草总RNA的提取
•       3.2.8.3 实时荧光定量PCR
•     3.2.9 数据分析与处理
•       3.2.9.1 酶活鉴定数据处理
•       3.2.9.2 qRT-PCR数据处理
• 4 结果与分析
•   4.1 原核表达载体pCzn1-NtGCN2（1-437aa）的构建
•     4.1.1 NtGCN2（1-437aa）序列的克隆
•     4.1.2 pCzn1-NtGCN2（1-437aa）的构建
•     4.1.3 pCzn1-NtGCN2（1-437aa）的双酶切鉴定
•   4.2 NtGCN2（1-437aa）的原核表达及Western Blot鉴定
•     4.2.1 NtGCN2（1-437aa）的原核表达
•     4.2.2 NtGCN2（1-437aa）重组蛋白的鉴定
•   4.3 重组蛋白的纯化
•     4.3.1 NtGCN2（1-437aa）蛋白的纯化
•     4.3.2 NtGCN2全长蛋白的纯化
•   4.4 多克隆抗体的制备及效价检测
•     4.4.1 NtGCN2全长蛋白的抗体制备及效价检测
•     4.4.2 NtGCN2（1-437aa）的抗体制备及效价检测
•     4.4.3 NtGCN2全长多克隆抗体的鉴定
•     4.4.4 NtGCN2（1-437aa）多克隆抗体的鉴定
•   4.5 NtGCN2的体外性质鉴定
•   4.6 NtGCN2互作基因的RT-PCR验证
• 5 结论与讨论
• 6 小结
• 参考文献
• 英文摘要

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 郝英辰

导师: 张松涛

关键词: 激酶,原核表达,蛋白质纯化,体外鉴定

来源: 河南农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,农作物

单位: 河南农业大学

基金: 河南省自然科学基金(No.182300410065)

分类号: Q945.78;S572

DOI: 10.27117/d.cnki.ghenu.2019.000130

总页数: 52

文件大小: 3151K

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