非典型猪瘟病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

论文摘要

参照GenBank上登录的非典型猪瘟病毒（atypical porcine pestivirus virus,APPV）全基因组序列设计特异性引物成功从感染APPV阳性样品中扩增出270 bp的APPV基因片段,并将其克隆到pEASY-Bluent Zero Cloning Kit载体,以纯化的重组质粒为模板优化反应条件,建立了检测APPV的特异性荧光定量PCR方法。结果显示,建立的荧光定量PCR方法Ct值与标准品在1.49×101～1.49×1010copies/μL呈现良好的线性关系,相关系数为R20.999,斜率为-3.442,扩增效率为95.207%。该方法与PCV2、PRV、PRRSV、PPV及CSFV基因组均无交叉反应,敏感性比常规PCR高出1 000倍,组内和组间重复试验变异系数均小于2%。对临床采集的20份疑似感染APPV的样品进行检测,结果显示应用所建立的荧光定量PCR成功检测到3份APPV阳性样品,而常规PCR仅检测到1份,表明所建立的荧光定量PCR比常规PCR灵敏度更高。本试验所建立的APPV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,可实现对APPV早期诊断及感染进行定量分析检测。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1 毒株与菌株
•   1.2 主要试剂和仪器
•   1.3 引物设计及合成
•   1.4 阳性标准品的制备
•     1.4.1 病毒RNA的提取
•     1.4.2 标准质粒构建
•     1.4.3 标准质粒浓度测定
•   1.5 标准曲线的建立
•   1.6 特异性检测
•   1.7 灵敏性试验及可重复性试验
•   1.8 临床样品检测
• 2 结果
•   2.1 目的基因扩增及标准质粒的构建
•   2.2 标准曲线绘制及溶解曲线分析
•   2.3 APPV荧光定量PCR检测方法的评价
•     2.3.1 敏感性
•     2.3.2 特异性
•   2.4 重复性检测
•   2.5 临床样品检测
• 3 讨论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 曹亮,田明尧,孙文超,郭丹丹,汪伟,鲁会军,刘云霞,郑敏,钱爱东,金宁一

关键词: 非典型猪瘟,仔猪先天震颤,荧光定量

来源: 中国兽医学报 2019年04期

年度: 2019

分类: 农业科技,基础科学

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 吉林农业大学动物科学技术学院,军事科学院军事兽医研究所,温州大学病毒学研究所,广西壮族自治区疾病预防控制中心

基金: 国家重点研发计划资助项目(2017YFD0501803,2017YFD0500101)

分类号: S852.651

DOI: 10.16303/j.cnki.1005-4545.2019.04.03

页码: 622-626

总页数: 5

文件大小: 800K

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