仙茅细胞悬浮培养生产仙茅苷的研究

论文摘要

仙茅（Curculigo orchioides Gaertn）为石蒜科仙茅属多年生草本,又名地棕、独茅、仙茅参,其根茎入药,主要用于治疗肾阳不足、阳痿遗精、虚痨内伤,筋骨疼痛等病症。随着对仙茅药用价值的深入了解,仙茅市场需求逐渐加大,仙茅野生资源受到破坏而大量减少,人工栽培仙茅也因土地资源、农药残留、季节影响、活性成分含量差异等因素影响而受到了限制。因此本课题决定采用植物细胞工程技术来生产仙茅苷,可以缩短仙茅资源的利用周期,更有效的保护仙茅种质资源,有利于仙茅产业的可持续发展与产业升级。本文以仙茅为材料,采用幼叶作为外植体诱导产生愈伤组织,经反复继代后,以MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/LNAA为培养基,在温度为25℃,转速120 r/min,光照12 h/d,光照强度1 200 lx条件下进行培养21d,成功建立了悬浮细胞系。对悬浮细胞系在培养过程中的生物量、pH、PAL酶活性和代谢产物进行了相关研究,结果表明悬浮细胞系在一定的培养周期内能产生仙茅苷等代谢产物,但含量较低,且与细胞生物量,PAL酶活性,pH变化呈相关关系。通过响应面试验设计研究接种密度、振荡频率、碳源浓度、以及生长调节剂2,4-D等因素对细胞增殖的影响,结果表明:各因素促进细胞增殖的最佳响应水平为,接种量73.94 g/L、2,4-D0.59mg/L、摇床转速103.75 r/min、碳源浓度40.28g/L,在此条件下经实验验证,所得悬浮细胞生长良好,最大生物量为15.26±0.3×105个/mL。通过研究不同光照、温度、pH条件处理对仙茅细胞生长与仙茅苷合成的影响,结果表明,光照条件为12h/d,1200x,温度为26℃时,初始pH为5.8～6.2时,有利于仙茅细胞生长与仙茅苷的合成。通过研究不同前体和诱导子条件处理对仙茅细胞生长与仙茅苷合成的影响结果表明,添加L-苯丙氨酸、茉莉酸甲酯、水杨酸均能促进仙茅苷的生物合成。当L-苯丙氨酸为100mg/L时,仙茅苷的含量最高为3.32±0.18 mg/g干重,为对照组的2.48倍。茉莉酸甲酯为100 μmol/L时,仙茅苷含量最高为2.54±0.24 g/L干重,为对照组1.85倍。水杨酸为50 μmol/L,仙茅苷含量最高为3.088 mg/g干重,为对照组的2.36倍。通过研究前体和诱导子处理对悬浮细胞培养液PAL酶活、总糖耗量和pH变化的影响,结果表明,前体L-苯丙氨酸,诱导子茉莉酸甲酯和水杨酸均能加大细胞的糖耗量,诱导子茉莉酸甲酯和水杨酸可提高悬浮细胞PAL酶活性与悬浮培养液pH。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
•   引言
•   1.1 仙茅的研究进展
•     1.1.1 仙茅的生物学特征及资源分布
•     1.1.2 仙茅化学成分及药理作用的研究
•   1.2 仙茅苷的研究进展
•     1.2.1 仙茅苷化学结构及理化性质
•     1.2.2 仙茅苷药理研究
•     1.2.3 仙茅苷在植物体生物合成途径
•   1.3 植物细胞悬浮培养研究进展
•     1.3.1 植物组织细胞悬浮培养技术的概述
•     1.3.2 植物细胞培养技术的应用
•     1.3.3 植物细胞悬浮培养的影响因素
•   1.4 植物细胞培养生产次生代谢产物的研究进展
•     1.4.1 植物细胞悬浮培养生产次生代谢产物的影响因素
•     1.4.2 仙茅组织细胞培养的研究现状
•   1.5 选题的目的及意义
•   1.6 主要研究内容
•   1.7 技术路线
• 第二章 仙茅愈伤组织诱导和细胞悬浮培养体系的建立
•   2.1 材料与方法
•     2.1.1 试验材料
•     2.1.2 实验药品
•     2.1.3 实验仪器
•     2.1.4 愈伤组织诱导
•     2.1.5 继代过程中的褐化防治
•     2.1.6 植物生长调节剂对愈伤组织增殖倍数的影响
•     2.1.7 仙茅细胞悬浮体系的建立
•     2.1.8 仙茅细胞生长过程研究
•   2.2 结果与分析
•     2.2.1 不同浓度NAA,6-BA对仙茅愈伤组织诱导的影响
•     2.2.2 不同抗褐化剂对仙茅愈伤组织继代生长的影响
•     2.2.3 植物生长调节剂对愈伤组织增殖倍数的影响
•     2.2.4 仙茅细胞悬浮体系的建立
•     2.2.5 仙茅悬浮细胞生长过程研究
•   2.3 讨论
•   2.4 小结
• 第三章 仙茅液体悬浮培养快速增殖的技术体系建立
•   3.1 材料与方法
•     3.1.1 供试材料
•     3.1.2 实验药品
•     3.1.3 实验仪器
•     3.1.4 接种量对仙茅悬浮细胞生长的影响
•     3.1.5 摇床转速对仙茅悬浮细胞生长的影响
•     3.1.6 2,4-D对仙茅悬浮细胞生长的影响
•     3.1.7 碳源浓度对仙茅悬浮细胞生长的影响
•     3.1.8 响应面优化试验
•   3.2 结果与分析
•     3.2.1 接种量对仙茅悬浮细胞生长的影响
•     3.2.2 摇床转速对仙茅悬浮细胞生长的影响
•     3.2.3 2,4-D对仙茅悬浮细胞生长的影响
•     3.2.4 碳源浓度对仙茅悬浮细胞生长的影响
•     3.2.5 响应面结果与分析
•   3.3 讨论
•   3.4 结论
• 第四章 培养环境条件对仙茅悬浮细胞生长与仙茅苷积累的影响
•   4.1 材料与方法
•     4.1.1 实验材料
•     4.1.2 实验药品
•     4.1.3 实验仪器
•     4.1.4 光照对仙茅悬浮细胞生长和仙茅苷含量影响
•     4.1.5 温度对仙茅悬浮细胞生长和仙茅苷含量影响
•     4.1.6 pH对仙茅悬浮细胞生长和仙茅苷含量的影响
•   4.2 结果与分析
•     4.2.1 光照对仙茅悬浮细胞生长和仙茅苷含量影响
•     4.2.2 温度对仙茅悬浮细胞生长和仙茅苷含量影响
•     4.2.3 初始pH对仙茅悬浮细胞生长和仙茅苷含量的影响
•   4.3 结论
• 第五章 前体和诱导子对仙茅悬浮细胞生长与仙茅苷积累的影响
•   5.1 材料与方法
•     5.1.1 实验材料与药品
•     5.1.2 实验仪器
•     5.1.3 L-苯丙氨酸处理对仙茅细胞生长与仙茅苷含量的影响
•     5.1.4 茉莉酸甲酯处理对仙茅细胞生长与仙茅苷含量的影响
•     5.1.5 水杨酸处理对仙茅细胞生长与仙茅苷含量的影响
•     5.1.6 前体和诱导子联合使用对仙茅悬浮细胞生长与仙茅苷含量的影响
•     5.1.7 L-苯丙氨酸、茉莉酸甲酯和水杨酸处理对仙茅悬浮细胞PAL酶活的影响
•     5.1.8 L-苯丙氨酸、茉莉酸甲酯和水杨酸处理对悬浮培养液pH值的影响
•     5.1.9 L-苯丙氨酸、茉莉酸甲酯和水杨酸处理对悬浮培养液总糖含量的影响
•   5.2 结果与分析
•     5.2.1 L-苯丙氨酸对仙茅悬浮细胞生长与仙茅苷含量的影响
•     5.2.2 茉莉酸甲酯对仙茅悬浮细胞生长与仙茅苷含量的影响
•     5.2.3 水杨酸对仙茅悬浮细胞生长与仙茅苷含量的影响
•     5.2.4 前体和诱导子联合使用对仙茅悬浮细胞生长与仙茅苷含量的影响
•     5.2.5 L-苯丙氨酸、茉莉酸甲酯和水杨酸处理对仙茅细胞PAL酶活性的影响
•     5.2.6 L-苯丙氨酸、茉莉酸甲酯和水杨酸处理对悬浮培养液pH的影响
•     5.2.7 L-苯丙氨酸、茉莉酸甲酯和水杨酸处理对悬浮培养液总糖含量的影响
•   5.3 讨论
•   5.4 结论
• 第六章 结论与展望
•   6.1 结论
•   6.2 创新点
•   6.3 展望与建议
• 参考文献
• 附录A 彩页图
• 附录B 攻读硕士学位期间的主要学术成果
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 邹璐

导师: 何钢

关键词: 仙茅,仙茅苷,细胞悬浮培养,次生代谢物

来源: 中南林业科技大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 中南林业科技大学

基金: 国家林业公益性行业科研专项项目“仙茅,鸡血藤资源培育及林下种植技术研究(201304807)”

分类号: Q943.1

总页数: 82

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