诱导多能干细胞来源小胞外囊泡提取方法的建立及优化

论文摘要

研究目的:近年来已有大量研究证明诱导多能干细胞（hi PSCs）来源的小胞外囊泡（s EVs）（hi PSCs-s EVs）在各类疾病中发挥治疗作用,然而目前对于s EVs来源供体细胞的收集培养上清时所用培养液条件及细胞状态并没有明确的报道,因此本文研究的目的是探索在提取hi PSCs-s EVs时,hi PSCs的培养条件及其能否维持细胞的正常状态,以确保在减少外来物质对s EVs干扰的同时提取具有生物学活性的s EVs。1、根据hi PSCs的生长及分化状态确定收集培养上清时所需条件培养基的组成;2、进一步确定可收集培养上清的天数;3、改良s EVs的提取方法提取hi PSCs来源的s EVs;4、通过检测形态、大小等验证提取的s EVs的物理学特性;5、验证s EVs表面标志蛋白的表达;6、利用Hep G2细胞证明提取的s EVs的生物学活性。研究方法:1、利用连续16h超速离心法制备去除细胞外囊泡的血清替代物（KSR）（ED-KSR）;2、配制含有不同浓度（0%、0.25%、0.5%、2%、5%和20%）ED-KSR的条件培养基（CM）;3、hi PSCs生长至一定密度后更换不同浓度CM,24h后利用相差显微镜观察细胞形态,流式细胞仪检测不同浓度CM中细胞的生存率,BCA和SDS-PAGE分别测定不同浓度CM中提取出的s EVs蛋白浓度以及条带分布,并确定最适宜的ED-KSR浓度;4、在0.5%CM中连续收集培养上清5d,并利用流式细胞仪测定分别收集1d,3d,5d时hi PSCs的存活率,碱性磷酸酶染色（ALP）、干性标志物OCT4、SEEA4和SOX2的免疫荧光染色、干性标志物NANOG、OCT4和SOX2的q RT-PCR分析检测hi PSCs的多能性,确定收集培养上清的时间;5、采用改良的超速离心法（M-UC）和Exo-Quick试剂盒（EQ）提取s EVs,并利用透射电子显微镜（TEM）、纳米颗粒追踪分析（NTA）、蛋白印迹（WB）验证所提取的s EVs的大小、形态以及蛋白表达;6、PKH67标记s EVs,鉴定是否能被受体细胞Hep G2摄取;7、不同浓度的s EVs加入到Hep G2中,观察其对受体细胞的作用。研究结果:更换0%、0.25%、0.5%、2%、5%和20%六种浓度ED-KSR配制的CM 24h后,相差显微镜下观察两株hi PSCs的形态,发现与干细胞培养基中培养的hi PSCs相比,0.5%、2%、5%和20%CM中的细胞形态没有显著变化,均呈特征性的未分化状态,且流式细胞仪检测结果的数据分析显示各组间差异无统计学意义（P>0.05）,然而,0%和0.25%CM中hi PSCs的形态已经发生轻微改变,并开始出现分化现象,细胞存活率也显著低于对照组（P<0.05）;BCA结果显示0.5%、2%、5%和20%CM中收集的来源于两株hi PSCs的s EVs的蛋白浓度分别为4.36±0.53、7.5±2.0、10.2±1.2、14.99±1.12;4.36±0.54、7.14±0.68、10.67±1.84、13.63±0.06,各组间差异显著（P<0.05）,且SDS-PAGE结果也显示KSR中的蛋白对0.5%CM中提取的s EVs干扰最小,上述结果均表明0.5%ED-KSR为适宜的CM浓度;随后在0.5%CM中连续收集培养上清5天后,发现细胞的形态无明显变化,且流式细胞仪检测结果显示hi PSCs的存活率有浮动,但数据分析显示此差异无统计学意义（P>0.05）;碱性磷酸酶染色、OCT4、SEEA4和SOX2的免疫荧光、NANOG、OCT4和SOX2的q RT-PCR分析结果均显示hi PSCs在收集5天后仍表达hi PSCs多能性标志,呈未分化状态;采用M-UC和EQ两种方法提取s EVs,TEM结果显示提取的s EVs均为50-200nm,椭圆形或圆形的双层膜性小囊泡,NTA结果显示两种方法提取的s EVs大小分别为186.6±2.6 nm、167.5±2.0 nm,;Western Blotting结果显示两株hi PSCs细胞来源的s EVs表达标记蛋白CD63,TSG101和HSP70,不表达钙网蛋白Calreticulin;另外,PKH67染色实验表明,s EVs可被受体细胞Hep G2内吞,并以颗粒形式聚集在细胞质中,且达到一定浓度的s EVs可以促进细胞增殖。研究结论:在维持hi PSCs多能性及存活率的条件下,0.5%ED-KSR为收集hi PSCs培养上清时所用条件培养基的适宜浓度,并且可连续收集5天;M-UC和EQ两种方法均可提取具有促进受体细胞增殖的生物活性的s EVs,为后续的功能研究提供基础。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩略语/符号说明
• 前言
•   研究现状、成果
•   研究目的、方法
• 一、优化诱导多能干细胞的培养上清收集条件
•   1.1 对象和方法
•     1.1.1 实验对象
•     1.1.2 主要实验耗材
•     1.1.3 主要实验仪器
•     1.1.4 主要实验试剂
•     1.1.5 主要试剂配制
•     1.1.6 hi PSCs-EC1和hi PSCs-HF1的培养
•     1.1.7 去除s EVs的KSR（ED-KSR）的制备
•     1.1.8 条件培养基的配制及收集
•     1.1.9 小胞外囊泡 （s EVs）的提取
•     1.1.10 蛋白提取及检测
•     1.1.11 流式细胞仪检测细胞生存率
•     1.1.12 碱性磷酸酶检测
•     1.1.13 细胞免疫荧光检测
•     1.1.14 RNA的提取与检测
•     1.1.15 数据统计
•     1.1.16 分析软件
•   1.2 结果
•     1.2.1 正常培养条件下2株hi PSCs的镜下观察
•     1.2.2 不同浓度条件培养基中两株hi PSCs的镜下形态
•     1.2.3 流式细胞仪检测结果
•     1.2.4 蛋白质浓度测定及SDS-PAGE电泳结果
•     1.2.5 收集不同天数后两株hi PSCs的细胞形态观察
•     1.2.6 收集不同天数后两株hi PSCs的流式细胞仪检测结果
•     1.2.7 收集不同天数后两株hi PSCs的碱性磷酸酶染色结果
•     1.2.8 免疫荧光检测 hi PSCs-EC1 和 hi PSC-HF1 表面标志物表达结果
•     1.2.9 RT-PCR检测hi PSCs-EC1和hi PSC-HF1表面标志物表达
•   1.3 讨论
•     1.3.1 利用ED-KSR配制条件培养基
•     1.3.2 0.5% CM中可连续收集培养上清 5d
•   1.4 小结
• 二、诱导多能干细胞来源的s EVs鉴定
•   2.1 对象和方法
•     2.1.1 实验对象
•     2.1.2 主要实验耗材
•     2.1.3 主要实验仪器
•     2.1.4 主要实验试剂
•     2.1.5 试剂配制
•     2.1.6 s EVs的透射电子显微镜（TEM）鉴定
•     2.1.7 s EVs的纳米粒子跟踪分析（NTA）鉴定
•     2.1.8 hi PSCs和s EVs的Western Blotting分析
•     2.1.9 Hep G2细胞的培养
•     2.1.10 PKH67标记s EVs
•     2.1.11 PKH67-s EVs与Hep G2细胞共培养
•     2.1.12 hi PSCs-s EVs与Hep G2细胞共培养
•     2.1.13 Hep G2细胞中RNA提取和定量逆转录聚合酶链反应（q RT-PCR）
•     2.1.14 数据统计
•   2.2 结果
•     2.2.1 透射电子显微镜结果
•     2.2.2 纳米颗粒跟踪分析结果
•     2.2.3 Western Blotting结果
•     2.2.4 Hep G2可内吞PKH67-s EVs
•     2.2.5 s EVs可促进Hep G2增殖
•   2.3 讨论
•     2.3.1 M-UC和EQ均可提取出s EVs
•     2.3.2 Western Blotting证明hi PSCs-s EVs表达其标志蛋白
•     2.3.3 hi PSCs-s EVs可进入Hep G2并促进其增殖
•   2.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 综述 小胞外囊泡在肝脏疾病中的研究进展
•   参考文献
• 致谢
• 个人简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 高敦芹

导师: 高英堂

关键词: 诱导多能干细胞,多能性,收集,小细胞外囊泡,培养条件

来源: 天津医科大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 天津医科大学

分类号: R329.2

DOI: 10.27366/d.cnki.gtyku.2019.000621

总页数: 86

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