一、棉铃虫核多角体病毒细胞凋亡抑制基因iap~3的序列分析（论文文献综述）
康涛涛[1]（2019）在《BmNPV iap2基因对宿主细胞凋亡的调控机制研究》文中提出家蚕既是重要的泌丝经济昆虫,也是蚕桑产业和历史文化的重要载体。而家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,Bm NPV）是养蚕生产上最常见的、危害最严重的一类家蚕病原微生物。Bm NPV是完全的胞内寄生生物,其自身基因组简单,不具细胞结构,通常利用宿主的营养物质和信号通路来完成自身的生命周期。病毒感染宿主细胞会引发宿主的一系列反应,如细胞凋亡、DNA损伤应答、热休克反应和能量代谢等。其中,细胞凋亡作为机体重要的生物学过程,受内外环境变化或凋亡信号触发,其是在基因调控下所发生的清除衰老、多余和受损细胞以维持自身稳定的一种自我调节方式。细胞凋亡几乎存在于所有的多细胞生物,在生物体生长发育、组织分化和细胞免疫维持内环境稳定过程中扮演重要角色。病毒本身随着宿主防御系统进化而协同进化,进而逃逸宿主细胞的抗病毒机制。昆虫缺乏哺乳动物的获得性免疫系统,而细胞凋亡作为其重要的免疫应答组成部分,这对研究病毒与宿主相互作用,及病毒如何利用宿主信号通路来实现自身增殖复制是一个很好的切入点。本研究对家蚕核型多角体病毒凋亡抑制因子Bm NPV iap2基因进行功能鉴定,探究Bm NPV IAP2及其相互作用蛋白在Bm NPV侵染过程中对宿主细胞凋亡调控的机制,初步解析Bm NPV iap2基因在Bm NPV增殖过程中的作用机制,为解析Bm NPV利用Bm NPV iap2基因调控宿主细胞凋亡利于自身增殖提供理论依据。主要研究结果和结论如下:1.Bm NPV iap2基因的功能鉴定通过序列分析发现Bm NPV iap2基因的ORF长750 bp,编码249个氨基酸（aa）,预测蛋白质分子量为28.72 k Da,等电点为9.51。蛋白结构域预测表明Bm NPV IAP2从80 aa到153 aa为BIR结构域,202 aa到236 aa为N端RING结构域。系统发生树分析结果显示杆状病毒IAP2主要以α-杆状病毒为主,具有相对较高的保守性,此外,杆状病毒的IAP2与昆虫IAP关系较近（尤以鞘翅目、膜翅目为主）,该结果与推测杆状病毒IAP是通过昆虫水平转移相一致。成功构建了BmNPV iap2基因的真核过表达载体和基于CRISPR/Cas9的敲除载体,Bm NPV iap2基因的过表达载体转染家蚕Bm E-SWU1细胞,免疫荧光结果表明Bm NPV IAP2主要定位于细胞质,Western Blotting检测到约30.71 k Da处存在特异性条带;基于CRISPR/Cas9在Bm NPV中成功敲除Bm NPV iap2基因,通过Hoechst染色、TUNEL检测、Caspase活性检测分析和流式细胞术等技术检测显示,在Bm NPV侵染Bm E-SWU1细胞中,敲除Bm NPV iap2基因后细胞核染色质固缩呈典型凋亡小体,与对照相比,敲除Bm NPV iap2基因凋亡小体比例达到20%。此外,与对照相比,TUNEL检测绿色荧光明显增强,Caspase-9和Caspase-3/7活性均显着上升,凋亡细胞比例增加11%,表明Bm NPV iap2经CRISPR/Cas9敲除后引发细胞凋亡;利用q RT-PCR技术和Western Blotting技术,过表达Bm NPV iap2上调病毒基因ie1和vp39表达,促进Bm NPV增殖,敲除Bm NPV iap2下调病毒基因ie1和vp39表达,抑制Bm NPV增殖。2.BmNPV IAP2相互作用蛋白的鉴定为了鉴定Bm NPV IAP2的调控网络,以Bm NPV IAP2为诱饵,进行免疫共沉淀-质谱分析,筛选到Bm NPV IAP2可能的相互作用蛋白Bm PP5和Bm HSP60,通过荧光共定位和免疫共沉淀等方法鉴定其与Bm NPV IAP2的确存在相互作用。Bm PP5从19 aa到120 aa为三个串联TPR结构域,195 aa到471 aa为PP2Ac结构域,可能参与了线粒体细胞周期;HSP60从359 aa到395 aa为Coiled coil结构域,556 aa到572 aa为Low complexity结构域,主要参与蛋白质到线粒体的正确靶向、蛋白质“从头”折叠和热激反应等。成功构建了Bmpp5和Bm Hsp60基因的真核过表达载体及基于CRISPR/Cas9的敲除载体,通过Hoechst染色和Caspase活性检测分析显示,敲除Bm Hsp60、Bmpp5细胞核染色质固缩,呈现典型的凋亡小体,与对照相比,敲除Bm Hsp60、Bmpp5凋亡小体比例分别达到12%和15%。此外,与对照相比,Caspase-9和Caspase-3/7活性均显着上升,说明Bmpp5和Bm Hsp60基因经CRISPR/Cas9敲除后引发细胞凋亡。此外,Bm HSP60在抗病毒方面的研究已经报道,本文着重研究关于Bm PP5的抗病毒功能。通过q RT-PCR技术和Western Blotting技术,过表达Bmpp5上调病毒基因ie1和vp39表达,促进Bm NPV增殖;敲除Bmpp5下调病毒基因ie1和vp39表达,抑制Bm NPV增殖。为进一步探索Bm NPV IAP2相互作用蛋白对Bm NPV IAP2的调控,Bm NPV侵染过程中,在转录水平及蛋白水平利用q RT-PCR和Caspase活性检测分析技术分析,结果表明,过表达Bmpp5上调表达Bm NPV iap2;敲除Bmpp5下调表达Bm NPV iap2。Caspase活性检测分析表明,敲除Bmpp5影响Bm NPV iap2抑制细胞凋亡功能。3.Bm NPV iap2、Bmiap和Bmpp5共同调控宿主细胞凋亡确定Bm NPV IAP2、Bm IAP和Bm PP5两两之间存在相互作用。利用q RTPCR分析Bm NPV侵染过程中Bmiap、Bmpp5与Bm NPV iap2基因的表达模式,结果表明Bm NPV侵染过程中,Bmiap表达下调,Bmpp5与Bm NPV iap2上调表达。为了探究Bm NPV利用Bm NPV iap2调控宿主细胞凋亡机制,通过q RT-PCR和Western Blotting技术在转录水平及蛋白水平研究Bm NPV iap2、Bmiap和Bmpp5共同调控宿主细胞凋亡和Bm NPV增殖复制,结果证明Bm NPV侵染过程中,Bm NPV iap2和Bmpp5上调表达Bmiap;过表达Bm NPV iap2和Bmpp5能增强Bmiap抗H2O2诱导的细胞凋亡。此外,过表达Bm NPV iap2和Bmpp5能增强Bmiap引起的促进病毒增殖作用。
任彬元,钟万芳,郭慧芳[2]（2014）在《斜纹夜蛾核型多角体病毒安徽和县株系细胞凋亡抑制相关基因的克隆与遗传变异》文中提出为分析核型多角体病毒（NPV）分离株内细胞凋亡抑制相关基因的多态性,从安徽和县采集感染病毒的斜纹夜蛾病虫,分离出斜纹夜蛾核型多角体病毒（Spodoptera litura nucleopolyhedrovirus,Splt NPV）15个活体克隆株系,研究其细胞凋亡抑制基因（IAP）和P49基因多态性。发现15个Splt NPV安徽和县克隆株系中的IAP基因序列均无差异,且与已报道的Splt NPV中国G2株的同源性达100%;Splt NPV各克隆株系中的P49基因序列也无差异,且与Splt NPV中国G2株的P49基因同源性达99%。表明Splt NPV安徽和县株系IAP和P49基因均较为保守,没有表现出遗传变异。
陈立坤[3]（2013）在《LdNPV-Bt复配及LdNPV不同分离株致病性和致病基因研究》文中提出舞毒蛾在中国的种群属于亚洲型舞毒蛾（AGM）,亚洲型舞毒蛾雌雄成虫均具有飞行能力,传播能力强,危害较大。因此,急需国内相关防治、检疫机关和科研组织加强对国内舞毒蛾的防控,寻找更多生态、有效防治舞毒蛾的方法。通过苏云金芽孢杆菌（Bt）与舞毒蛾核型多角体病毒（LdNPV）混合使用、以及LdNPV高毒力株的筛选来提高舞毒蛾核型多角体病毒对舞毒蛾的致病性。并研究了国内外不同品系毒株对不同区域舞毒蛾幼虫的致病性差异,比较了5株LdNPV增效基因E1、UDP-葡糖基酶基因（egt）和细胞凋亡抑制基因iap-3的核苷酸与氨基酸序列之间的差异,为探索LdNPV致病基因的致病性提供理论参考。Bt与LdNPV（?）昆合使用结果表明,Bt稀释16000倍液对病毒仍具有增效作用,增效倍数为0.16倍；Bt稀释8000倍液对病毒增效倍数为1.93倍；病毒在2.5×107,2.5×106,2.5×105OBs/mL浓度均对Bt表现出增效作用,增效倍数分别为2.02、1.61、0.58倍；而2.5×104OBs/mL与2.5×103OBs/mL病毒溶液对Bt分别表现出相加和拮抗作用。野外混合使用时,套笼实验中Bt、LdNPV单剂和Bt与LdNPV复配3种不同药剂处理中混合药剂杀虫高峰出现在第8d,幼虫死亡率在第4d低于Bt杀虫剂,高于LdNPV杀虫剂第13d的死亡率,平均死亡率混合处理最高,为69.65%；灌木喷洒虫口密度调查表明混合处理出现2个高峰分别为第5d和第16d,单剂Bt与LdNPV处理分别为6d和18d,平均虫口密度降低率混合处理最高,为38.67%,该混合处理不仅克服了Bt杀虫剂在持续性上的不足,也加快了LdNPV杀虫速度。对国内外采集到的舞毒蛾核型多角体病毒加拿大毒株（Ld-J）、美国1毒株（Ld-M1）、美国2毒株（Ld-M2）,内蒙毒株（Ld-N）,实验室毒株（Ld-S）对5个地域和实验室传代试虫进行毒力筛选,结果表明内蒙毒株毒力效果最好,平均半致死浓度（LC50）为47.86OBs/μL,最低值达到11.56OBs/μL,而半致死时间（LT50）为16.38d,最低达到10.28d,均低于其它毒株。国内毒株和国外毒株LC5o与LTso比较发现,国内2个品系的毒株要优于美国和加拿大3个品系的毒株,这可能与实验试虫为本地品系有关。毒株分化对毒力产生了显着的影响,而毒株针对分布于不同区域试虫的致病性也存在显着的差异。对5个毒株的egt基因、E1基因和iap-3基因的氨基酸序列相似性比较发现,egt-N和E1-N均出现了一个较大的变化,较其它毒株相似性为最低。与NCBI序列相比,egt-N有153处氨基酸的变化,有4处氨基酸的插入,5处氨基酸的缺失；E1-N有26个位置的氨基酸发生改变,有2处氨基酸的插入。iap-N未表现出与其它毒株有较大差异。这与生测结果,LdNPV-N致病性最强的结果是相一致的。同源性树状图显示,egt-N与其它毒株同源性要低。而iap-S表现出与其它毒株同源性稍远,与E1-N同源性较高。北美毒株之间的同源性要高于国内毒株。这也充分说明毒株在地理区域内出现分化,国内毒株与国外毒株存在同源性上的差异,这与舞毒蛾地理种的差异也是相一致的。通过研究我们认为LdNPV与Bt配以适当比例复配不仅能够提高室内外毒杀舞毒蛾的效力,也能提高舞毒蛾致死时间。对国内外5种LdNPV毒株的毒力差异分析发现LdNPV内蒙株为一株高毒力株,国内2株毒株对不同区域舞毒蛾幼虫致病性要强于北美3株LdNPV毒株。5株LdNPV3个致病基因中,内蒙毒株的El与egt基因与其它毒株出现较大差异,这与内蒙株毒力较高一致。
王成燕[4]（2012）在《混合侵染和交替传代对斜纹夜蛾核型多角体病毒宿主域和毒力影响及机制》文中认为核型多角体病毒（Nucleopolyhedrovirus, NPV）作为一类昆虫病原微生物,资源丰富,对害虫作用独特且对环境安全,是一种理想的害虫生物防治剂。但天然的昆虫病毒因宿主范围窄、作用速度慢和作用活性低,大大限制了其在生产上的应用。如何打破昆虫病毒的专化性以及提高它们的毒力成了拓宽昆虫病毒应用范围的重点和难点。NPV间自然重组现象较为普遍,不同NPV间重组可产生宿主域扩大病毒；另外病毒的毒力与宿主密切相关,在一种新宿主中的连续传代可提升其对传代宿主毒力,不过其对原宿主毒力显着下降。病毒在两种不同宿主中交替传代后,病毒能否对两种宿主同时具有高毒力?尚无实验证明。因此,研究不同病毒混合侵染后的宿主域变化及其在不同宿主中交替传代过程中的毒力演化对于揭示病毒进化规律及发掘宿主域扩大和病毒毒力提升具有着重要意义。本研究以鳞翅目重大害虫斜纹夜蛾Spodoptera litura和甜菜夜蛾S. exigua为靶标对象,首先研究两种病毒混合侵染后的宿主域变化,接着研究宿主域扩大病毒在甜菜夜蛾和斜纹夜蛾中交替传代时的毒力演化,最后研究病毒多角体超微结构变化和遗传变异,主要研究结果如下：1病毒混合侵染后的宿主域扩大和交替传代时的毒力演化本文选用不能经口感染甜菜夜蛾的斜纹夜蛾NPV （SINPV）日本福冈株和不能经口感染斜纹夜蛾的甜菜夜蛾NPV （SeNPV）美国株,将它们共同侵染甜菜夜蛾后,获得了能同时感染甜菜夜蛾和斜纹夜蛾的宿主域扩大病毒株系,其对斜纹夜蛾的致病力与SINPV相当,致死中浓度（LC50值）无显着差异,同时对甜菜夜蛾也具备了一定的侵染力,但尚显着低于SeNPV对甜菜夜蛾的毒力。进一步将该病毒在甜菜夜蛾和斜纹夜蛾这两种宿主中按4种模式进行交替传代,分别为以甜菜夜蛾和斜纹夜蛾为起始宿主的严格交替传代,以及以甜菜夜蛾和斜纹夜蛾为起始宿主的非严格交替传代,研究病毒毒力的演化规律。发现宿主域扩大病毒在经历斜纹夜蛾和甜菜夜蛾多代交替传递过程中,其对甜菜夜蛾的毒力有显着上升,且对斜纹夜蛾的毒力未有显着下降,但在传递20代过程中,除从斜纹夜蛾开始的严格交替传代模式下,病毒对甜菜夜蛾的毒力一直呈上升趋势,以甜菜夜蛾为起始宿主的严格交替模式以及两种非严格交替传代模式下,病毒对甜菜夜蛾毒力未一直呈上升趋势,在14代以内显着上升,此后则有所下降。研究表明两种宿主中的交替传代可以提高病毒对一种宿主的适应性且同时保持了其对另一种宿主的适应性。2混合侵染和交替传代后多角体超微结构变化通过透射电镜观察研究了病毒混合侵染和交替传代后其多角体超微结构变化。比较了混合侵染前、混合侵染后、交替传代后以及连续传代后病毒的多角体超微结构。观察结果表明,各病毒均属多粒包埋型病毒,混合侵染没有引起病毒多角体大小的改变,多角体直径无显着差异。但经以斜纹夜蛾为起始宿主的交替传代以及在斜纹夜蛾中的连续传代后,病毒多角体的直径显着减小。同时还发现混合侵染和交替传代都没有造成病毒多角体内病毒束数量的改变,多角体内病毒束平均数量在各病毒间无显着差异。但带来病毒束内核衣壳数量的变化,经过混合侵染及在甜菜夜蛾和斜纹夜蛾中的一次交替传代后,病毒束内平均病毒核衣壳数较起始的SINPV福冈株显着下降,在经历20代次交替后,仍显着低于福冈株,而在斜纹夜蛾中连续传代时病毒核衣壳的数量未有显着变化。另外从各病毒束内不同核衣壳的分布来看,SeNPV美国株中病毒束内核衣壳分布均匀,62.5%病毒束中病毒核衣壳数量为3个,而其余病毒则分布较广,在以斜纹夜蛾为起始宿主的交替传代后的病毒中,病毒核衣壳的数量在1-12个间。研究表明,SeNPV和SlNPV昆合侵染以及在两种宿主中交替繁殖后能够改变其多角体的组装,从而带来多角体超微结构的变化。3混合侵染后宿主域扩大病毒polh和iap基因变异通过基因组酶切、基因克隆分析研究了病毒混合侵染后的遗传变异。病毒基因组DNA限制性酶切结果表明,混合侵染后宿主域扩大病毒的基因组DNA酶切图谱较混合侵染前的SINPV福冈株没有产生明显变化,Pst Ⅰ、Hind Ⅲ、EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ这4种限制性酶切图谱均与混合侵染前一致。进一步对病毒多角体蛋白基因（polh）分析发现,病毒混合侵染后其polh基因序列较混合侵染前SlNPV在第281个碱基上发生突变,氨基酸序列也发生相应的变化。另还对宿主域扩大病毒细胞凋亡抑制基因（iap）进行了克隆,发现其与已报道的SpliNPV iap基因同源性达95%,与SlNPV中国株G2iap基因同源性和SlNPV日本株iap同源性均只有80%。4混合侵染和交替传代后病毒全基因组序列变化分析对混合侵染和交替传代前后三个病毒株系的全基因组序列进行了分析,研究发现,SlNPV和SeNPV经过混合侵染后产生的宿主域扩大病毒,在基因组大小上较SlNPV福冈株变小,基因数量也有变化,少了1个基因,基因总长度也有增加；再经过交替传代,基因总长度进一步变长。再从各病毒基因总长度占基因组的百分比来看,混合侵染后产生的宿主域扩大病毒较混合侵染前SlNPV基因总长度占基因组百分增加,再经交替传递20代后,百分比进一步增加。各病毒株系GC含量变化不大。病毒基因组全序列具体分析则发现混合侵染后病毒lef-8（晚期表达因子）基因产生了一个碱基的变化,另外病毒基因组内有一个255bp片段的插入,且在进一步交替传递20代后,此变化仍存在。
徐利[5]（2011）在《棉铃虫核型多角体病毒（HearNPV）ORF80基因功能的研究》文中研究表明HearNPV ORF80高度保守,是杆状病毒30个核心基因之一,也是病毒粒子的非结构基因,但其功能尚不清楚。本文制备了ORF80的多克隆抗体并构建了缺失ORF80的重组杆状病毒。通过转染和病毒的扩增初步分析缺失该基因对复制的影响。从HearNPV G4株基因组中克隆得到了ORF80基因的全序列,将该基因构建于pMAL-c4E载体并在TB1中得到融合表达,ORF80的融合蛋白大小为73.3kD,与预测的蛋白大小一致,Western blot验证正确。纯化融合蛋白后制备抗原并注射新西兰大白兔从而得到了ORF80的多克隆抗体,经ELISA检测其效价达到了2.56×105,表明该抗体具有较高的免疫原性。该抗体可以用作ORF80基因在细胞中表达的检测及蛋白互作等相关研究。利用Red重组系统构建了ORF80功能区域缺失的HearNPV△80 Bacmid。对重组Bacmid进行PCR和基因组酶切鉴定表明缺失ORF80的杆状病毒载体构建成功。将重组Bacmid转染进HzAM1细胞中,检测确定了HearNPV△80 Bacmid形成的BV粒子的ORF80被成功删除。用重组的HearNPV△80 Bacmid转染HzAM1细胞可以观察到荧光的出现,表明转染成功,HearNPV△80 Bacmid可以在细胞中正常表达。收集转染后的细胞上清液感染健康细胞未出现荧光,细胞形态也没有发生变化,表明缺失该基因导致无法正常产生重组病毒HearNPV△80的BV。研究结果表明:ORF80基因是HearNPV的一个必需基因,但其在病毒生活史中的确切功能还有待进一步深入研究。
薛贵收[6]（2009）在《SpltMNPV重组病毒的构建和SpltMNPV-JP-G1-2iap基因的克隆》文中研究指明斜纹夜蛾（Spodoptera litura）是各种农作物和绿化植物的重要害虫,能够危害109科389种寄主植物。目前,生产上对于斜纹夜蛾的防治主要侧重于化学防治,但效果并不理想。从保持生态平衡和降低化学农药对环境污染的战略考虑,利用斜纹夜蛾核型多角体病毒（spodoptera litura multicapsid nucleopolyhedrovirus,SpltMNPV）防治农作物害虫已成为国内外生物防治的重要内容之一。但是,它也有一定的局限性,在野外条件下,杀虫速度较慢,对高龄害虫需用量大以及宿主域窄等缺点限制了其广泛应用。为了克服上述不足,最重要的方法之一就是应用基因工程和分子生物学等手段,通过缺失某一基因并表达昆虫选择性毒素基因。本研究对野生型斜纹夜蛾核型多角体病毒（SpltMNPV）日本株G1-2的凋亡抑制基因-iap基因进行克隆与序列分析;对野生型斜纹夜蛾核型多角体病毒（SpltMNPV）日本株G1-2和G10-3进行改造,通过缺失polh或egt基因并插入由多角体启动子pph启动外源毒素.蝎毒素基因以及增强型绿色荧光蛋白标记基因（enchanced greenfluorescent protein gene,egfp）基因,构建了新的基因工程重组病毒。主要工作成果如下:1、克隆了SpltMNPV-JP-G1-2的凋亡抑制基因iap,该基因大小为411bp,其编码区共编码136个氨基酸,预计蛋白分子量15.67kD（GenBank的登录号为FJ384668）。采用生物信息学方法对iap基因进行了分子系统发育分析。2、利用昆虫病毒分子生物学和基因工程理论、方法和技术对具有强烈杀虫活性的斜纹夜蛾核型多角体病毒日本株进行基因工程改造。成功构建了8个SpltMNPV重组转移载体,为构建和筛选重组斜纹夜蛾杆状病毒杀虫剂奠定了基础。3、进行了基因工程重组斜纹夜蛾核型多角体病毒的尝试。使用10个重组转移载体与野生型SpltMNPV DNA共转染Spli细胞,通过同源重组和有限稀释法筛选,初步获得了三个重组病毒SpltMNPV-△egtG1-2-p10-egfp-pph-Bt、SpltMNPV-△egtG1-2-p10-egfp-pph-BmK ITal和SpltMNPV-△egtG10-3-pph-egfp,为进一步开展斜纹夜蛾的生物防治研究打下了良好的基础。
余倩[7]（2008）在《斜纹夜蛾核多角体病毒诱导细胞凋亡的研究》文中提出杆状病毒感染昆虫细胞可诱导细胞凋亡（apoptosis）,细胞凋亡作为一种宿主范围决定因子限制了杆状病毒的杀虫范围,影响杆状病毒杀虫剂在生物防治中的应用;然而,在长期进化过程中,杆状病毒获得了抗凋亡基因以阻止细胞凋亡,使其能够正常复制。在已测序的杆状病毒中绝大部分都包含两个或两个以上的抗凋亡基因,但是部分体外实验结果表明,并不是所有抗凋亡基因都具有抗细胞凋亡活性。本研究首次利用RNAi技术对斜纹夜蛾核多角体病毒（Spodoptera litura nucleopolyhedrovirus, SpltNPV）中两个抗凋亡基因Splt-iap4和Splt-p49在SpltNPV受纳宿主中的抗凋亡功能进行研究,通过瞬时表达检测探讨两个基因在SpltNPV非受纳宿主中的抗凋亡功能,同时对抗凋亡基因与其宿主的进化关系进行了初步探讨。主要结果如下:PCR扩增得到Splt-p49基因和Splt-iap4基因,分别将其连接到含有两个反向T7启动子的质粒载体上,体外转录得到大片段的双链RNA （double strain RNA, dsRNA）,将dsRNA分别或同时转染至被SpltNPV病毒感染的SpLi-221细胞以沉默Splt-iap4或Splt-p49,或者同时沉默Splt-iap4和Splt-p49的转录。经光学显微镜观察、DNA ladder检测、细胞存活率计算以及病毒滴度测定,结果说明SpltNPV感染SpLi-221细胞时,Splt-P49具有抗凋亡功能,而Splt-IAP不具有这种功能。但实验中发现,SpltNPV感染SpLi-221细胞在48 h之前细胞会聚集成团,而Splt-iap4 dsRNA处理细胞未出现此现象,大部分依然是独立的单个细胞,推断Splt-iap4基因在病毒感染期间起到了某种作用使得细胞的聚集受阻,但Splt-iap4的功能与病毒产生可感染性的子代病毒无关。在vAcAnh感染Sf9系统中,分别瞬时表达Splt-iap4和Splt-p49两基因,经光学显微镜和细胞存活率计算方法检测,结果同样显示Splt-P49具有抗凋亡功能而Splt-IAP不具有抗凋亡功能,且Splt-IAP无辅助抗凋亡功能或延迟细胞凋亡功能。最后对杆状病毒中的抗凋亡基因与其来源宿主进行进化分析,结果显示亲缘关系相近的杆状病毒所含的抗凋亡类型也相近,说明抗凋亡基因与杆状病毒进化有着密切的关系,也可能发挥着重要作用。斜纹夜蛾（Spodoptera litura）和甜菜夜蛾（S. exigua）同属夜蛾科（Noctuidae）灰翅夜蛾属的昆虫,亲缘关系很近,且SpltNPV和甜菜夜蛾核多角体病毒（Spodoptera exigua multiple nucleopolyhedrovirus, SeMNPV）基因组相似性很高,但这两种病毒并不能交叉感染各自宿主。本文从细胞水平和亚显微水平对SpltNPV感染非受纳宿主离体细胞Se301的过程进行了描述,并对感染失败的原因进行了初步的生化分析。光学显微镜显示,被SpltNPV感染的Se301细胞在感染后24 h至120 h期间细胞出现了明显的病理现象,包括细胞空泡,细胞聚集等,且随着时间的延长病理症状越来越严重,但感染细胞中始终没有病毒多角体。DAPI染色荧光观察和电镜观察结果,都表明从24 h至120 h各样品中均显示细胞出现了早期凋亡的特征,但未形成晚期凋亡特征的凋亡小体。TCID50检测表明病毒没有产生有感染性的芽生型子代病毒。Dot blotting显示,在被感染的Se301细胞中可完成病毒DNA的复制; RT-PCR分析也显示,感染细胞72 h时,SpltNPV的早、晚期基因都有转录;Western blotting没有检测到被感染细胞中有极晚期基因polyhedrin的表达。以上结果表明,SpltNPV的感染可导致Se301细胞出现明显的早期凋亡症状,但不能进行到凋亡的最后阶段;虽然病毒可完成DNA的复制且早、晚期基因均有转录,但病毒的感染不能发展至极晚期,说明早期细胞凋亡仍然是限制病毒完成复制周期的重要因素。
曾宪东[8]（2007）在《杆状病毒AcMNPViap基因功能及分子机理的研究》文中研究指明细胞凋亡是宿主细胞防御病毒入侵的重要策略，同时进化过程中病毒也获得了相应的调节细胞凋亡的机制。杆状病毒是最早发现参与调节宿主细胞凋亡的病毒之一，对于杆状病毒的凋亡调节基因的研究大大加深了对病毒与宿主细胞相互作用以及细胞凋亡的分子机制的认识。杆状病毒编码的凋亡抑制基因主要有三类，即p35、p49和iap（inhibitor of apoptosis）。P35蛋白作为多种caspase的底物自杀性抑制剂是一个广谱的强而有效的凋亡抑制因子，P49是P35的同源体，而分布广泛的iap基因家族已经成为了新的研究热点，但仅有少数几个杆状病毒iap基因的功能得到鉴定。苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒（Autographa california nucleopolyhedrovirus，AcMNPV）是杆状病毒的模式种，它编码一个p35基因以及两个功能尚未证实的iap基因。缺失p35 AcMNPV能诱导其AcMNPV敏感的草地贪夜蛾（Spodoperta frugiperda）Sf细胞凋亡，利用该系统鉴定了多个凋亡抑制基因，如Cp-iap和Op-iap。在本实验室的研究发现缺失p35的AcMNPV与野生型病毒一样能完全抑制棉铃虫核多角体病毒（Helicoverpa armigera NPV，HearNPV）诱导的Tn-Hi5细胞凋亡，推测iap1与iap2是功能性的凋亡抑制基因。瞬时表达分析研究证实了AcMNPV IAP1与IAP2均功具有抑制细胞凋亡的功能。由于AcMNPV与HearNPV共感染不仅抑制了HearNPV诱导的Tn-Hi5细胞的凋亡，而且能拯救HearNPV在Tn-Hi5中的复制，为此构建了分别表达AcMNPV p35、iap1与iap2的重组HearNPV，感染试验发现重组病毒诱导的凋亡显着下降且极晚期启动的egfp基因获得表达，而且用电镜观测到了重组病毒在Tn-Hi5细胞均产生的病毒粒子。为了进一步探讨AcMNPV IAPs在Tn-Hi5细胞中起作用的机制，我们表达了IAP2以及两个源自昆虫细胞的效应caspase，即Bm-caspase-1和Tn-caspase-1，体外活性分析表明了原核表达的Bm-caspase-1能够自我激活并可以激活酶原形式的Tn-caspase-1，而且IAP2可抑制Bm-caspase-1的蛋白酶活性。本研究首次证实了AcMNPV的IAP1／2作为功能性的凋亡抑制蛋白发挥作用，也进一步揭示了凋亡抑制子IAP家族蛋白功能和作用机制的细胞特异性。
朱丽娜[9]（2007）在《甜菜夜蛾核型多角体病毒及其宿主抑制凋亡蛋白的功能研究》文中研究指明本论文共分五章。第一章为引言。主要介绍了甜菜夜蛾及其防治状况，杆状病毒的主要特征及应用情况，细胞凋亡抑制蛋白IAP以及组织蛋白酶B（CB）的研究概况。第二章主要内容为甜菜夜蛾抑制凋亡基因iap在哺乳动物细胞293 HEK中的功能研究。我们从甜菜夜蛾脂肪体中提取总RNA，反转录成cDNA做为模板，根据GenBank中公布的甜菜夜蛾iap序列设计引物，扩增出甜菜夜蛾iap基因，其大小为1134 bp。将PCR产物克隆到真核表达载体pGEFP-C1。用鉴定正确的重组质粒pEGFP-iap转染293 HEK细胞，并用治疗肿瘤的药物顺铂（cisplatin）诱导细胞凋亡。通过对比实验组及对照组细胞的存活率，表明甜菜夜蛾iap基因在哺乳动物细胞中发挥了预期的抑制凋亡功能。第三章主要内容为甜菜夜蛾核型多角体病毒（Spodoptera exigua nucleopolyhedrovirus，SeNPV）抑制凋亡基因iap2及iap3在哺乳动物细胞293HEK中的功能研究。我们以SeNPV基因组为模板，根据已知的杆状病毒iap基因序列设计引物，采用PCR技术扩增出SeNPV的iap2、iap3基因，其大小分别为951 bp和939 bp。将PCR产物克隆到真核表达载体pGEFP-C1。用鉴定正确的重组质粒pEGFP-iap2、-iap3分别转染293 HEK细胞，并用治疗肿瘤的药物顺铂（cisplatin）诱导细胞凋亡。通过对比实验组及对照组细胞的存活率，表明甜菜夜蛾病毒iap3基因在哺乳动物细胞中发挥了预期的抑制凋亡功能。第四章主要内容为棉铃虫抑制凋亡基因iap的获得。我们从棉铃虫脂肪体中提取总RNA，反转录成cDNA做为模板，根据鳞翅目昆虫粉蚊夜蛾（Trichoplusia ni），草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）的iap基因的同源序列，设计引物，扩增出棉铃虫iap基因的一段保守序列。再根据测序结果设计引物分别进行3’RACE和5’RACE扩增，将所得片段克隆至pMD18-T载体并测序，以获得棉铃虫iap基因的cDNA全长。第五章主要内容为甜菜夜蛾组织蛋白酶B基因cb的获得。我们从甜菜夜蛾血淋巴中提取总RNA，反转录成cDNA做为模板，根据本实验室已经获得的甜菜夜蛾cb基因中间段及3’RACE序列设计引物，进行5’RACE扩增，将所得片段克隆至pMD18-T载体并测序，以获得甜菜夜蛾cb基因的cDNA全长。
李萌[10]（2007）在《棉铃虫核型多角体病毒ORF34、ORF44的序列分析与原核表达》文中提出棉铃虫核型多角体病毒（HearNPV）可特异性侵染棉铃虫,是理想的棉铃虫生物防治因子。HearNPV的两个分离株C1、G4的基因组全序列已经测定,一些基因的功能已经阐明,ORF34、ORF44是两个功能未知的基因。本研究对ORF34、ORF44基因进行了克隆、序列分析和原核表达研究,首次分析并确认了HearNPV的ORF34、ORF44基因为HearNPV的特有基因,基因表达产物也为后续研究提供了基础。HearNPV ORF34基因全长1080nt,编码359aa,预测编码蛋白分子量为41.2 kDa。序列分析显示,ORF34具有三个杆状病毒早期和晚期基因转录启动子特征序列。分析发现ORF34的推导氨基酸序列中含有1个强跨膜螺旋区域,15个磷酸化位点和1个糖基化位点。除HzNPV ORF34外,未发现与ORF34氨基酸同源性高于30%的基因。构建了pET-34表达载体,并在大肠杆菌BL21中得到了表达,表达的融合蛋白分子量为42kDa,与预测编码蛋白分子量大小相符。序列分析研究结果表明ORF34是HearNPV的一个特有基因。HearNPV ORF44基因全长1137nt,编码378aa,预测编码蛋白分子量为42.7kDa。序列分析显示,ORF44具有双相启动子特征序列,同时兼有杆状病毒早期和晚期基因转录启动子特征序列。分析发现ORF44的推导氨基酸序列中含有1个强跨膜螺旋区域,32个磷酸化位点和4个糖基化位点。除HezeNPV ORF45外,未发现与ORF44氨基酸同源性高于30%的基因。构建了pET-44表达载体,并在大肠杆菌BL21中得到了高效表达,表达的融合蛋白分子量为44 kDa,与预测编码蛋白分子量大小相符。序列分析研究结果表明ORF44是HearNPV的一个特有基因,ORF44融合蛋白的成功表达为进一步制备多克隆抗体,深入研究HearNPV ORF44奠定了基础。
二、棉铃虫核多角体病毒细胞凋亡抑制基因iap~3的序列分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、棉铃虫核多角体病毒细胞凋亡抑制基因iap~3的序列分析（论文提纲范文）
（1）BmNPV iap2基因对宿主细胞凋亡的调控机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 细胞凋亡研究进展 |
| 1.1.1 细胞凋亡概述 |
| 1.1.2 细胞凋亡途径 |
| 1.1.3 细胞凋亡的检测方法 |
| 1.2 IAP基因研究进展 |
| 1.2.1 IAP基因概述 |
| 1.2.2 IAP基因结构域及功能分析 |
| 1.2.3 IAP介导Caspase细胞凋亡的机制 |
| 1.2.4 IAP介导其他信号通路 |
| 1.3 杆状病毒与宿主互作研究 |
| 1.3.1 杆状病毒概述 |
| 1.3.2 杆状病毒与宿主相互作用 |
| 1.3.3 杆状病毒IAP与病毒感染研究进展 |
| 第二章 引言 |
| 2.1 研究背景和目的意义 |
| 2.2 主要研究内容 |
| 2.3 技术路线 |
| 第三章 BmNPV iap2 基因的功能鉴定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 主要试剂及溶液配制 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 主要实验方法及步骤 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 BmNPV iap2 基因的序列分析 |
| 3.2.2 BmNPV iap2 的功能鉴定 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 BmNPV IAP2 相互作用蛋白的鉴定 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 主要试剂及溶液配制 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.1.4 主要实验方法及步骤 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 BmNPV IAP2 相互作用蛋白的筛选 |
| 4.2.2 BmNPV IAP2 相互作用蛋白特征分析及亚细胞定位 |
| 4.2.3 BmNPV IAP2 相互作用蛋白的鉴定 |
| 4.2.4 BmNPV IAP2 相互作用蛋白对宿主细胞凋亡的影响 |
| 4.2.5 BmNPV IAP2 相互作用蛋白对病毒增殖的影响 |
| 4.2.6 BmNPV IAP2 相互作用蛋白对BmNPV IAP2 的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 BmNPV iap2、Bmiap和 Bmpp5 共同调控宿主凋亡 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 主要试剂及溶液配制 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.1.4 主要实验方法及步骤 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 BmNPV IAP2、BmIAP和 BmPP5 相互作用鉴定 |
| 5.2.2 BmNPV侵染过程中BmNPV iap2、Bmiap和 Bmpp5 基因表达 |
| 5.2.3 BmNPV iap2和Bmpp5对Bmiap的影响 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 总结与结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在读期间发表论文及参研课题 |
| 致谢 |
（2）斜纹夜蛾核型多角体病毒安徽和县株系细胞凋亡抑制相关基因的克隆与遗传变异（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 病毒基因组DNA提取 |
| 1.2.2 细胞凋亡抑制相关基因克隆 |
| 1.2.3 核苷酸序列比较分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 细胞凋亡抑制基因 (IAP) 的克隆和序列分析 |
| 2.2 P49基因克隆和序列分析 |
| 3 讨论 |
（3）LdNPV-Bt复配及LdNPV不同分离株致病性和致病基因研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 舞毒蛾的研究进展 |
| 1.2 舞毒蛾核型多角体病毒的研究进展 |
| 1.3 苏云金芽孢杆菌防治舞毒蛾的研究进展 |
| 1.4 核型多角体病毒与Bt的复配研究进展 |
| 1.5 舞毒蛾核型多角体病毒增效基因1(Enhancinl,E1,vef-1)基因、UDP-转葡糖基酶基因(egt)和细胞凋亡抑制基因(iap-3)的分子机制的研究进展 |
| 1.6 研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验仪器设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 Bt和LdNPV的致死中浓度(LC_(50))测定 |
| 2.3.2 LdNPV 5个毒株对6个地域3龄舞毒蛾的LC_(50),LT_(50)测定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 致死中浓度测定 |
| 3.1.1 Bt的LC_(50)测定 |
| 3.1.2 LdNPV的LC_(50)测定 |
| 3.2 Bt与LdNPV混合使用的毒力筛选 |
| 3.2.1 室内毒力试验 |
| 3.2.2 林间防治试验 |
| 3.3 不同品系LdNPV对不同地理品系舞毒蛾幼虫的致死中浓度比较 |
| 3.4 不同品系LdNPV对不同地理品种舞毒蛾幼虫的致死中时间比较 |
| 3.5 5种LdNPV增效基因、egt基因与iap-3基因相似性分析及进化分析 |
| 3.6 5株LdNPV-egt基因核苷酸序列比较分析 |
| 3.7 5株LdNPV-E1基因序列比较分析 |
| 3.8 5株LdNPV-iap-3基因序列比较分析 |
| 3.9 5个LdNPV毒株egt基因、El基因和iap-3基因的进化分析 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（4）混合侵染和交替传代对斜纹夜蛾核型多角体病毒宿主域和毒力影响及机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 综述 |
| 1 昆虫病毒的种类及应用现状 |
| 1.1 核型核多角体病毒 |
| 1.2 颗粒体病毒 |
| 1.3 质型多角体病毒 |
| 1.4 昆虫痘病毒 |
| 2 病毒重组拓宽病毒杀虫谱研究进展 |
| 2.1 昆虫病毒自然重组拓宽杀虫谱 |
| 2.2 运用基因工程技术扩大宿主域 |
| 3 宿主中连续传代提升病毒毒力研究进展 |
| 4 病毒宿主域和毒力及杀虫速度相关基因研究进展 |
| 4.1 与宿主域相关的基因 |
| 4.2 与毒力速度相关的基因 |
| 5 论文研究内容及目的意义 |
| 5.1 研究内容 |
| 5.2 研究目的与意义 |
| 5.3 技术路线 |
| 第二章 混合侵染和交替传代时斜纹夜蛾核型多角体病毒宿主域扩大和毒力演化 |
| 摘要 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 两种核型多角体病毒混合侵染后的宿主域扩大 |
| 2.2 宿主域扩大病毒交替传代时对斜纹夜蛾毒力的演化 |
| 2.3 宿主域扩大病毒对甜菜夜蛾毒力的演化 |
| 3 讨论 |
| 第三章 混合侵染和交替传代后病毒多角体超微结构变化 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病毒 |
| 1.2 病毒的蔗糖密度梯度离心 |
| 1.3 超薄切片样品制备 |
| 2 结果分析 |
| 2.1 透射电镜观察结果 |
| 3 讨论 |
| 第四章 混合侵染后宿主域扩大病毒polh和iap基因研究 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 病毒混合侵染前后基因组DNA限制性酶切图谱比较 |
| 2.2 宿主域扩大病毒polh基因变异 |
| 2.3 宿主域扩大病毒Iap基因的克隆 |
| 3 讨论 |
| 第五章 病毒宿主域扩大和毒力提升后其全基因组变异分析 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病毒 |
| 1.2 病毒DNA的提取 |
| 1.3 DNA浓度测定 |
| 1.4 基因组全序列测定分析 |
| 2 结果分析 |
| 2.1 全基因组序列分析和基因预测 |
| 2.2 混合侵染和交替传代后病毒基因组变异分析 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（5）棉铃虫核型多角体病毒（HearNPV）ORF80基因功能的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 杆状病毒简介 |
| 1.2 棉铃虫核型多角体病毒分子生物学研究进展 |
| 1.2.1 棉铃虫核型多角体病毒基因研究分类 |
| 1.2.2 HearNPV ORF80 基因研究进展 |
| 1.3 棉铃虫核型多角体病毒作为杀虫剂的研究进展 |
| 1.3.1 插入外源基因 |
| 1.3.2 缺失内源基因 |
| 1.3.3 过量表达内源基因 |
| 1.3.4 其它可行办法 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌种、载体、细胞和病毒 |
| 2.1.2 试剂、血清和培养基 |
| 2.1.3 引物 |
| 2.1.4 其它 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 ORF80 基因的原核表达 |
| 2.2.2 多克隆抗体的制备 |
| 2.2.3 缺失ORF80 的重组Bacmid 构建 |
| 2.2.4 转染及病毒粒子的回收 |
| 2.3 常规实验试剂配制 |
| 2.4 技术路线 |
| 第三章 结果和分析 |
| 3.1 ORF80 基因的原核表达 |
| 3.1.1 ORF80 基因表达载体的构建 |
| 3.1.2 表达载体pMAL-c4E-Ha80在TB1中的表达 |
| 3.2 多克隆抗体的制备 |
| 3.3 缺失ORF80 重组Bacmid 的构建 |
| 3.3.1 同源片段的扩增 |
| 3.3.2 同源重组及其鉴定 |
| 3.3.2.1 pKD46质粒的鉴定 |
| 3.3.2.2 缺失ORF80的重组Bacmid的构建及其鉴定 |
| 3.4 转染和ORF80 的表达检测 |
| 3.5 重组型病毒粒子的回收 |
| 第四章 结论与讨论 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 缩略语 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（6）SpltMNPV重组病毒的构建和SpltMNPV-JP-G1-2iap基因的克隆（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 昆虫杆状病毒杀虫剂的研究与应用 |
| 1 高毒力野生型NPV的筛选、鉴定与药剂开发 |
| 2 基因工程重组NPV病毒 |
| 3 安全性评价 |
| 4 前景展望 |
| 参考文献 |
| 第二章 SpltMNPV-JP-G_(1-2)凋亡抑制基因iap的克隆与序列分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 SpltMNPV重组转移载体的构建和鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 斜纹夜蛾重组杆状病毒的筛选与鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 在读期间公开发表的研究论文 |
| 致谢 |
（7）斜纹夜蛾核多角体病毒诱导细胞凋亡的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 杆状病毒诱导的细胞凋亡及 RNAi 技术(文献综述) |
| 1.1 核多角体病毒 |
| 1.2 杆状病毒感染与宿主的关系 |
| 1.3 杆状病毒宿主专一性 |
| 1.4 细胞凋亡概念及其形态学特征 |
| 1.5 细胞凋亡与细胞坏死区别 |
| 1.6 细胞凋亡的分子机制 |
| 1.7 杆状病毒感染引起的细胞凋亡研究 |
| 1.8 抗凋亡基因 |
| 1.8.1 p35基因 |
| 1.8.2 p49基因 |
| 1.8.3 iap 基因 |
| 1.9 RNAi 技术 |
| 1.9.1 RNAi 的发现与发展 |
| 1.9.2 RNAi 作用机制 |
| 1.9.3 RNAi 机制中的主要成员 |
| 1.9.4 用RNAi 方法研究特定基因功能的技术路线 |
| 第二章 Splt-iap4 和 Splt-p49 基因转录和翻译研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 Splt-iap4转录时相 |
| 2.2.2 Splt-p49转录时相 |
| 2.2.3 Splt-iap4表达时相 |
| 2.2.4 Splt-p49表达时相 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 应用RNAi技术研究Splt-iap4和Splt-p49基因功能 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 Splt-iap4和Splt-p49基因的PCR扩增结果 |
| 3.2.2 对照cat基因的PCR扩增结果 |
| 3.2.3 重组质粒p28i-p49和p28i-iap的酶切鉴定 |
| 3.2.4 重组质粒p28i-cat的酶切鉴定 |
| 3.2.5 Splt-P49和Splt-IAP4凋亡功能检测 |
| 3.2.6 Splt-IAP4蛋白没有协同抗凋亡作用 |
| 3.2.7 Splt-IAP4对细胞有聚集作用 |
| 3.2.8 Splt-iap4 dsRNA处理对产生感染性病毒粒子的影响 |
| 3.2.9 RNAi对SpltNPV感染SpLi-221细胞的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 Splt- iap4 和 Splt-p49 瞬时表达及抗细胞凋亡活性研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 瞬时表达载体的构建 |
| 4.2.2 瞬时表达蛋白检测 |
| 4.2.3 Splt-Iap4和Splt-P49抗凋亡活性检测 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 杆状病毒与抗凋亡基因的进化关系研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 43株杆状病毒全基因组特征 |
| 5.2.2 43株杆状病毒全基因组中的抗凋亡基因 |
| 5.2.3 iap的序列比对和进化分析 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 SpltNPV感染诱导Se301细胞凋亡的检测与分析 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 材料 |
| 6.1.2 方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 光学显微镜观察SpltNPV 感染Se301细胞的形态学变化 |
| 6.2.2 电子显微镜观察SpltNPV 感染Se301细胞的形态学变化 |
| 6.2.3 DAPI染色 |
| 6.2.4 trypan blue染色 |
| 6.2.5 DNA ladder |
| 6.2.6 滴度测定 |
| 6.2.7 Dot blotting |
| 6.2.8 RT-PCR |
| 6.2.9 SDS-PAGE和Western blotting分析 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的论文 |
| 国内外会议论文摘要 |
| 缩略词 |
| 致谢 |
（8）杆状病毒AcMNPViap基因功能及分子机理的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1 细胞凋亡 |
| 2 细胞凋亡与杆状病毒 |
| 3 本研究的内容及意义 |
| 第二章 p35基因缺失型AcMNPV抑制HearNPV诱导Tn-Hi5细胞凋亡 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第三章 AcMNPViap1和iap2基因功能的研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第四章 Ac-IAP2与昆虫细胞caspase功能的体外分析 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 撰写发表文章 |
| 致谢 |
（9）甜菜夜蛾核型多角体病毒及其宿主抑制凋亡蛋白的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 引言 |
| 1 甜菜夜蛾概述 |
| 1.1 甜菜夜蛾在我国发生的为害 |
| 1.2 甜菜夜蛾的防治概况 |
| 1.3 甜菜夜蛾的抗药性现状 |
| 1.4 甜菜夜蛾的综合治理对策 |
| 2 杆状病毒概述 |
| 2.1 杆状病毒分类 |
| 2.2 杆状病毒的形态结构 |
| 2.3 杆状病毒的基因组结构 |
| 2.4 杆状病毒的侵染与复制 |
| 2.5 杆状病毒的应用 |
| 3 抑制凋亡蛋白 (Inhibitor of apoptosis) 概述 |
| 3.1 细胞凋亡概述 |
| 3.2 抑制凋亡蛋白(IAP) |
| 4 组织蛋白酶 B(Cathepsin B, CB)概述 |
| 4.1 CB 的生物学特性及生理功能 |
| 4.2 CB 基因和蛋白的结构特点 |
| 4.3 昆虫的 CB |
| 4.4 CB 的表达调控机制 |
| 4.5 CB 应用方面的研究 |
| 第2章 甜菜夜蛾抑制凋亡蛋白(IAP)在哺乳动物细胞中的功能研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 cDNA 文库的获得 |
| 1.3 pEGFP-iap 真核表达载体的构建及鉴定 |
| 1.4 哺乳动物细胞培养及转染前的准备 |
| 1.5 重组质粒转染 293 HEK 细胞 |
| 1.6 jap 功能检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 iap ORF 扩增及重组质粒构建结果 |
| 2.2 重组质粒转染 293 HEK 细胞结果 |
| 2.3 细胞计数及存活率计算 |
| 2.4 细胞凋亡检测结果 |
| 3 讨论 |
| 第3章 甜菜夜蛾核型多角体病毒 (SeNPV) 抑制凋亡蛋白(IAP)在哺乳动物细胞中的功能研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 iap2 和 iap3 基因的 PCR 扩增 |
| 1.3 iap2 和 iap3 真核表达载体的构建及鉴定 |
| 1.4 哺乳动物细胞培养及转染前的准备 |
| 1.5 重组质粒转染 293 HEK 细胞 |
| 1.6 iap3 功能检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 SeNPV iap2 和 iap3 基因的 PCR 扩增及重组质粒鉴定结果 |
| 2.2 重组质粒转染 293 HEK 细胞结果 |
| 2.3 细胞计数及存活率计算 |
| 2.4 细胞凋亡检测结果 |
| 3 讨论 |
| 第4章 棉铃虫抑制凋亡蛋白(IAP)基因的克隆 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 cDNA 文库的获得 |
| 1.3 RT-PCR |
| 1.4 3'RACE |
| 1.5 5'RACE |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 棉铃虫 iap 基因中间保守片断的获得 |
| 2.2 3'RACE 结果 |
| 2.3 5'RACE 结果 |
| 3 讨论 |
| 第5章 甜菜夜蛾组织蛋白酶 B(CB) 基因的 5'RACE |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 cDNA 文库的获得 |
| 1.3 5'RACE |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 已发表论文 |
| 致谢 |
（10）棉铃虫核型多角体病毒ORF34、ORF44的序列分析与原核表达（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 棉铃虫核型多角体病毒分子生物学研究进展 |
| 1 杆状病毒的分类 |
| 2 核型多角体病毒的生活史 |
| 3 棉铃虫核型多角体病毒分子生物学研究进展 |
| 3.1 HearNPV 基因组研究 |
| 3.2 HearNPV 基因功能研究 |
| 3.2.1 非结构蛋白基因 |
| 3.2.2 结构蛋白基因 |
| 第二章 主要研究内容和技术路线 |
| 1 主要内容 |
| 1.1 基因序列分析 |
| 1.2 原核表达 |
| 2 技术路线 |
| 2.1 基因序列分析 |
| 2.2 原核表达 |
| 第三章 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒、菌种和载体 |
| 1.2 工具酶和试剂盒 |
| 1.3 其它试剂 |
| 2 研究方法 |
| 2.1 PCR 反应 |
| 2.2 目的片段分离回收 |
| 2.3 双酶切反应 |
| 2.4 连接反应 |
| 2.5 氯化钙制备新鲜的感受态细胞 |
| 2.6 碱法质粒DNA 小量制备 |
| 2.7 质粒DNA 转化 |
| 2.8 外源基因在E.coli 中的表达 |
| 2.9 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 2.10 Western blot |
| 3 常规实验试剂配制 |
| 3.1 细菌培养基 |
| 3.2 碱法质粒抽提液 |
| 3.3 琼脂糖凝胶电泳 |
| 3.4 SDS-PAGE 试剂 |
| 3.5 Western blot 试剂 |
| 3.6 抗生素 |
| 3.7 RNA 酶（10mg/ml） |
| 第四章 HearNPV 基因 ORF34、ORF44 的序列分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 数据来源 |
| 1.2 分析方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 HearNPV ORF34 基因序列分析 |
| 2.2 HearNPV ORF44 基因序列分析 |
| 3 讨论 |
| 第五章 HearNPV 基因 ORF34、ORF44 的原核表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 引物设计 |
| 1.2.2 PCR 反应 |
| 1.2.3 ORF34、ORF 44 基因的克隆 |
| 1.2.4 ORF34、ORF 44 基因表达载体的构建 |
| 1.2.5 ORF34、ORF 44 在大肠杆菌中的表达 |
| 1.2.6 Western blot 分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 ORF34、ORF 44 基因的克隆 |
| 2.1.1 ORF34、ORF 44 基因的扩增 |
| 2.1.2 ORF34、ORF 44 基因克隆载体的鉴定 |
| 2.2 ORF34、ORF 44 基因表达载体的鉴定 |
| 2.3 ORF34、ORF 44 基因的诱导表达 |
| 3. 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
四、棉铃虫核多角体病毒细胞凋亡抑制基因iap~3的序列分析（论文参考文献）
- [1]BmNPV iap2基因对宿主细胞凋亡的调控机制研究[D]. 康涛涛. 西南大学, 2019(01)
- [2]斜纹夜蛾核型多角体病毒安徽和县株系细胞凋亡抑制相关基因的克隆与遗传变异[J]. 任彬元,钟万芳,郭慧芳. 江苏农业学报, 2014(06)
- [3]LdNPV-Bt复配及LdNPV不同分离株致病性和致病基因研究[D]. 陈立坤. 东北林业大学, 2013(03)
- [4]混合侵染和交替传代对斜纹夜蛾核型多角体病毒宿主域和毒力影响及机制[D]. 王成燕. 南京农业大学, 2012(04)
- [5]棉铃虫核型多角体病毒（HearNPV）ORF80基因功能的研究[D]. 徐利. 西北农林科技大学, 2011(05)
- [6]SpltMNPV重组病毒的构建和SpltMNPV-JP-G1-2iap基因的克隆[D]. 薛贵收. 苏州大学, 2009(10)
- [7]斜纹夜蛾核多角体病毒诱导细胞凋亡的研究[D]. 余倩. 中山大学, 2008(06)
- [8]杆状病毒AcMNPViap基因功能及分子机理的研究[D]. 曾宪东. 中国科学院研究生院（武汉病毒研究所）, 2007(06)
- [9]甜菜夜蛾核型多角体病毒及其宿主抑制凋亡蛋白的功能研究[D]. 朱丽娜. 中国科学院研究生院（武汉病毒研究所）, 2007(02)
- [10]棉铃虫核型多角体病毒ORF34、ORF44的序列分析与原核表达[D]. 李萌. 西北农林科技大学, 2007(06)