PRRSV GP5结合并诱导MYH9聚集促进病毒感染宿主细胞的研究

论文摘要

猪呼吸与繁殖综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）是一种引起猪繁殖障碍和呼吸系统疾病的重要病原。该病毒的爆发和传播给全世界范围内的猪业带来很大的经济损失。PRRSV属于尼多病毒目,动脉炎病毒科,是单股正链的RNA病毒,具有囊膜。PRRSV包括两种基因型型:欧洲型（或PRRSV-1型）和美洲型（或PRRSV-2型）。在我国主要流行的是美洲型,关于欧洲型的报道很少。PRRSV的天然宿主是猪肺泡巨噬细胞（PAM）,除PAM细胞之外,非洲绿猴肾细胞（MARC-145）也是常用的分离和培养PRRSV的细胞系。PRRSV感染宿主细胞的主要方式是通过受体介导的网格蛋白的内吞作用。CD163（SRCR）是重要的PRRSV受体,并且决定病毒的细胞嗜性。另一个不可或缺的细胞因子是非肌肉肌球蛋白重链II型A（NMHC IIA或MYH9）。唾液酸粘附素（Sialoadhesion,Sn,CD169）、似肝磷脂蛋白（Heparan sulphate,HS）、波形蛋白Vimetin、CD151和树突状细胞特异性细胞间黏附分子-3非整合素（DS-SIGN,CD209）也在PRRSV吸附感染过程中也发挥了重要的作用。MYH9是一种细胞骨架蛋白,参与细胞迁移,细胞有丝分裂,囊泡的转移和分泌和细胞内分子在微丝束上的移动等。MYH9是本实验室前期利用PRRSV GP5蛋白的抗独特性抗体Mab-5G2通过免疫共沉淀和质谱测序鉴定出来一个新的PRRSV细胞受体。根据C端序列的差异,将MYH9分为三种亚型:包括NMHC IIA（MYH9）、IIB（MYH10）和IIC（MYH14）。前期实验证明MYH9的C端（命名为PRA）特异性地与PRRSV的GP5蛋白结合并且促进病毒的进入。进一步研究发现MYH9可以通过与CD163的协同作用促进病毒进入宿主细胞。本论文的研究目的是研究MYH9与PRRSV GP5的特异性相互作用和形成的复合物的形态,以及在PRRSV早期感染宿主细胞过程中的作用。本研究的内容如下:1.PRRSV SD16毒株GP5截短蛋白的研究。构建原核表达质粒:pET-28a-GP5Δ-His并在E.coli中表达得到包涵体,利用梯度尿素进行包涵体复性,GP5Δ-His蛋白孵育MARC-145和PAM细胞,然后再感染SD16病毒,发现GP5Δ-His蛋白可以阻断大部分病毒的感染。利用相同的原核系统表达方式,得到GP5-ecto-1-His和GP5-C-His蛋白,同时做病毒阻断实验,实验结果表明,只有GP5-ecto-1可以阻断病毒的感染,而且对其他的毒株（JXA1、VR2332、P073-3和GZ11-G1）的感染,除了CH-1a毒株以外,有相同的抑制作用。通过分析CH-1a毒株的GP5-ecto-1序列,我们发现在F39位氨基酸的侧链具有与其他病毒不同的苯环。因此,GP5-ecto-1蛋白对大部分PRRSV毒株有阻断感染的作用,而且GP5-ecto-1是病毒粒子感染宿主细胞的关键区域。2.GP5与MYH9相互作用的研究。纯化的GP5Δ-His蛋白,与实验室原本保存的原核表达的PRA蛋白分别结合在ELISA 96孔板或PVDF膜上作为“诱饵蛋白”,再用PRA或GP5Δ-His孵育,5G2或anti-His抗体用来检测结合的蛋白。与无关蛋白sp239蛋白相比,GP5Δ-PRA或PRA-GP5Δ有明显的相互作用。为了进一步研究GP5Δ和PRA之间的相互作用是否有糖基化的参与,利用实验室前期构建的稳定表达GP5的细胞系MARC-145-GP5Flag,裂解后用PNGaseF或Neuraminidase药物处理细胞除去GP5表面的糖基化和唾液酸修饰,然后用anti-Flag抗体结合GP5,并沉淀出细胞系天然存在的MYH9。总而言之,GP5-MYH9的相互作用既有线性表位,也有构象表位的参与,而且GP5的糖基化和唾液酸修饰不影响蛋白之间的结合。为了找到GP5结合MYH9的区域,我们利用co-IP和His pull down实验发现,只有GP5和GP5-N可以与MYH9（或PRA）结合,而GP5-C不能与MYH9（或PRA）结合。Far western的实验结果进一步说明,GP5-ecto-1可以与PRA直接结合。GP5-ecto-1可以诱导MARC-145细胞内的MYH9聚集,而且,在细胞外表达的GP5-ecto-1/PRA蛋白复合物中,PRA形成粗的蛋白束,但是PRA和GP5-C/PRA复合物并没有出现这样的现象。将S100A4加入GP5-ecto-1/PRA复合物中时,PRA的蛋白束发生解聚。除此以外,co-IP和His pull down实验也发现,S100A4通过与GP5-ecto-1竞争性地结合MYH9（或PRA）,从而导致MYH9（或PRA）的解聚。3.MYH9介导PRRSV入侵的研究。将50 MOI SD16毒株吸附并感染MARC-145细胞和PAM细胞。细胞转入37℃后的0 min,5 min,15 min和30 min分别收集细胞并用激光共聚焦显微镜观察。在15 min时,细胞内MYH9聚集并且与PRRSV发生共定位（MARC-145细胞,在PAM细胞中是15 min和30 min）。同时,PRRSV的N蛋白水平在15 min有明显的提高。这些发现表明MYH9多聚体在PRRSV内化过程中发挥重要的作用。通过qPCR,western blot和激光共聚焦实验,发现内源性S100A4在PRRSV感染过程中没有明显的变化。在MARC-145细胞中过表达S100A4,PRRSV SD16毒株的早期内化（感染后30 min内）被显著地抑制。而且对其他PRRSV的毒株也有相同的抑制作用。以上结果表明,S100A4具有潜在的抗病毒作用。综上所述,本研究表明,GP5触发MYH9形成多聚体结构,并且MYH9聚集体在PRRSV的内化和进一步感染中发挥了重要的作用。本研究也为PRRSV感染的机制提供了新的内容和研究方向。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 主要符号对照表
• 第一章 文献综述
•   1.1 PRRSV的分子生物学研究现状
•     1.1.1 PRRSV的基因组结构和功能
•     1.1.2 PRRSV编码的非结构蛋白的功能
•     1.1.3 PRRSV编码的结构蛋白的功能
•   1.2 PRRSV的致病机制和免疫应答反应
•     1.2.1 PRRSV对细胞的致病作用和应答反应
•     1.2.2 PRRSV对机体的致病作用和应答反应
•     1.2.3 PRRSV感染引起的抗体依赖性增强作用（ADE）
•   1.3 PRRSV感染的相关细胞因子和入侵机制
•     1.3.1 CD163
•     1.3.2 唾液酸黏附素（Sialoadhesin）
•     1.3.3 硫酸乙酰肝素（heparan sulphate）
•     1.3.4 NMHC IIA（MYH9）
•     1.3.5 其他受体
•     1.3.6 PRRSV入侵机制
•   1.4 PRRSV的流行病学研究进展
•   1.5 PRRSV的诊断和预防
•     1.5.1 PRRSV的诊断研究进展
•     1.5.2 PRRSV的预防研究进展
•   1.6 本研究目的与意义
• 第二章 PRRSV SD16毒株GP5截短蛋白的研究
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 实验细胞,病毒和菌株
•     2.1.2 主要试剂和载体
•     2.1.3 主要仪器
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 GP5Δ,GP5-ecto-1 和GP5-C基因的克隆和原核表达载体构建
•     2.2.2 GP5Δ,GP5-ecto-1 和GP5-C蛋白的原核表达和纯化
•     2.2.3 GP5Δ,GP5-ecto-1 和GP5-C蛋白在PRRSV SD16毒株感染中的作用
•     2.2.4 检测GP5-ecto-1 和GP5-C蛋白对PRRSV其他毒株增殖的影响
•     2.2.5 细胞毒性检测
•   2.3 实验结果
•     2.3.1 GP5Δ,GP5-ecto-1 和GP5-C基因的PCR扩增和序列分析
•     2.3.2 GP5Δ,GP5-ecto-1 和GP5-C重组蛋白的表达和纯化
•     2.3.3 GP5Δ,GP5-ecto-1 和GP5-C对PRRSV病毒感染的影响
•   2.4 讨论
•   2.5 小结
• 第三章 GP5与MYH9相互作用的研究
•   3.1 实验材料
•     3.1.1 实验细胞和菌株
•     3.1.2 主要试剂和载体
•     3.1.3 主要仪器
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 PRA和S100A4蛋白的原核表达
•     3.2.2 GP5,GP5-N,GP5-C,GP5-ecto-1 和S100A4真核表达载体的构建
•     3.2.3 检测GP5糖基化和唾液酸修饰对GP5和MYH9相互作用的影响
•     3.2.4 检测GP5Δ 与PRA蛋白的相互作用
•     3.2.5 检测GP5与MYH9的相互作用的区域
•     3.2.6 检测GP5截短蛋白与MYH9蛋白复合物的形态
•     3.2.7 S100A4对GP5和MYH9复合物的影响
•   3.3 实验结果
•     3.3.1 PRA和S100A4蛋白的纯化
•     3.3.2 GP5糖基化和唾液酸修饰对GP5和MYH9相互作用的影响
•     3.3.3 GP5Δ 和PRA的相互作用的研究
•     3.3.4 GP5和PRA的相互作用的区域研究
•     3.3.5 GP5-ecto-1 和PRA复合物的研究
•     3.3.6 S100A4对GP5-ecto-1 和PRA复合物的影响
•   3.4 讨论
•   3.5 小结
• 第四章 MYH9介导PRRSV入侵的研究
•   4.1 实验材料
•     4.1.1 实验细胞和病毒
•     4.1.2 主要试剂
•     4.1.3 主要仪器
•   4.2 实验方法
•     4.2.1 检测PRRSV早期感染时MYH9的分布和形态变化
•     4.2.2 检测内源性S100A4在PRRSV SD16毒株早期感染时的变化
•     4.2.3 检测过表达S100A4蛋白对PRRSV SD16毒株早期感染的影响
•     4.2.4 检测过表达S100A4蛋白对PRRSV其他毒株早期感染的影响
•   4.3 实验结果
•     4.3.1 检测MYH9对PRRSV早期感染的影响
•     4.3.2 检测内源性S100A4对PRRSV早期感染的影响
•     4.3.3 过表达S100A4蛋白抑制MYH9聚集对PRRSV SD16毒株早期感染的影响
•     4.3.4 过表达S100A4蛋白抑制MYH9聚集对PRRSV其他毒株早期感染的影响
•   4.4 讨论
•   4.5 小结
• 第五章 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 个人简历

文章来源

类型: 博士论文

作者: 薛碧云

导师: 周恩民

关键词: 猪繁殖与呼吸综合征病毒,非肌肉肌球蛋白型重链,蛋白蛋白相互作用,病毒内化

来源: 西北农林科技大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 西北农林科技大学

基金: 国家自然科学基金项目重点项目(31430084)

分类号: S852.65

DOI: 10.27409/d.cnki.gxbnu.2019.000088

总页数: 99

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