一、DNA损伤与修复（论文文献综述）
许海军,阮豪杰,陈攀,李孟祥,高社干[1]（2021）在《DNA损伤与修复在食管癌中的研究进展》文中提出食管癌是全球第八大癌症,也是第六大最常见的癌症相关死亡原因。尽管近年来在手术联合放化疗方面取得了一些进展,但食管癌的预后仍然很差。食管癌发生的细胞和分子机制也尚待阐明。一些理化因素,如紫外线和γ射线,与人类癌症的发生密切相关。这些因素造成的DNA损伤是癌变的首要步骤。DNA损伤的有效修复依赖于进化中形成的DNA修复工具。受损的DNA复制如得不到有效修复,会导致基因突变,进而导致蛋白质改变。癌基因、肿瘤抑制基因或细胞周期控制基因的突变,可产生具有明显增殖优势的克隆细胞群。DNA复制和DNA损伤修复信号通路的基因高表达与食管癌患者的不良预后相关。本文总结DNA损伤与修复在食管癌中的研究进展。
严俊芳[2]（2021）在《电离辐射诱导非小细胞肺癌DNA损伤与线粒体功能紊乱的应答机理研究》文中认为肺癌作为全球第一大癌症,是威胁人类健康的凶险癌症类型。放射治疗作为疗效明确的肺癌治疗手段,被应用于肺癌治疗的各个阶段。放射治疗的辐射效应主要引起核基因组的损伤和细胞质损伤比如线粒体功能紊乱。重离子治癌作为先进的放射治疗手段,因其独特的物理优势,能诱发显着的生物学效应,明显提高肺癌病人的治愈率,但其机理仍不清楚。本文以非小细胞肺癌为研究对象,首先探究了X射线和碳离子以及两者联合博来霉素诱导的复杂DNA损伤的动态应答机制。其次,围绕碳离子单独或协同替加环素诱导线粒体功能紊乱展开研究,并对DNA损伤应答与线粒体功能紊乱的相互作用机制做了初步探究,重点阐述重离子治癌的生物学效应机理,使其治癌优势发挥更大。首先,本文对比X射线发现肺癌细胞对碳离子辐照更加敏感,且碳离子诱导的复杂DSB损伤频率较X射线增加。两种射线联合博来霉素后复杂DSB损伤频率为X射线<X射线联合博来霉素<碳离子<碳离子联合博来霉素。随着损伤频率的增加,识别因子γH2AX和53BP1更难募集到损伤位点,募集出现滞后现象。通过修复蛋白的差异表达分析发现,除X射线辐照外,其余各组非同源末端连接（NHEJ）修复因子Ku70的表达上调,而同源重组（HR）修复因子Rad51表达没有显着性差异,表明复杂DSB损伤修复可能以NHEJ为主。碳离子组和碳离子联合博来霉素组中单链损伤识别蛋白XRCC1的表达均下调,说明DNA单链断裂（SSB）逐渐被修复。下一步,对比抗肿瘤药物替加环素发现碳离子、替加环素及两者联合能够抑制A549和H1299细胞增殖并诱导线粒体功能紊乱,且联合作用诱导的毒性作用和线粒体功能紊乱最显着。线粒体功能紊乱体现在ATP产生降低,线粒体膜电势降低和线粒体Ca2+摄入量增加。在A549细胞中,碳离子、替加环素及两者联合作用诱导细胞凋亡。而在H1299细胞中,碳离子及两者联合作用诱导凋亡和自噬水平增加。在分子水平上,对比于替加环素的应答通路AMPK/mTOR,碳离子及联合作用通过Akt/AMPK/mTOR通路调控线粒体翻译蛋白影响线粒体翻译,从而调控线粒体功能,且P53缺陷株H1299细胞对线粒体翻译抑制敏感。最后,初步探究发现ATM/p53/mTOR信号通路是DNA损伤和线粒体功能紊乱的共同调控通路。ATM抑制增加了A549细胞对碳离子的辐射敏感性,主要表现在ATM抑制能够下调碳离子辐照后DSB修复因子Ku70和γH2AX的表达,降低DNA损伤修复能力,同时增加线粒体对Ca2+的摄取,导致线粒体功能紊乱。另外,抑制ATM能够降低辐照后p53磷酸化水平,增加mTOR的磷酸化。进一步发现p53磷酸化抑制后可通过降低AMPK磷酸化水平和激活Akt,从而上调mTOR活性。以上结果表明ATM不仅参与DSB修复,还可通过p53调控mTOR通路,进而调控线粒体功能。碳离子辐照24小时后,LC3-II/I比值发生下调,caspase-3活性增加,ATM抑制则能够下调LC3-II/I比值。因此,自噬水平的降低和细胞凋亡的增加共同决定了细胞的命运,ATM抑制则加重了这一现象。综上所述,本研究对比了X射线和重离子诱导的DNA损伤识别修复的动态应答过程,同时为重离子诱导线粒体功能紊乱提供了新的见解。最后,探究了DNA损伤修复和线粒体功能紊乱的的共同调控机制,连接了碳离子辐射后细胞核和线粒体的直接的双向信号,为重离子治癌提供了直接的生物学依据。
王聪聪[3]（2021）在《稻瘟病菌MoRAD26和MoMEC1在DNA损伤修复及致病过程中的功能分析》文中研究说明由丝状真菌稻瘟病菌（Maganporthe oryzae）引起的稻瘟病是水稻生产过程中最为严重的病害之一,研究稻瘟病菌的致病分子机制对稻瘟病的防治具有重要的现实意义。外界环境因素及生物体内源代谢等复合因素会影响生物体内基因组DNA的稳定性和完整性,但是生物体能够通过DDR（DNA Damage Response DNA损伤应答）信号级联途径激活不同的DNA损伤修复途径来应对不同类型的DNA损伤,并且能激活细胞自噬的发生。近年的研究表明细胞自噬在稻瘟病菌的生长发育、附着胞形成以及侵染栓侵染水稻细胞等的过程发挥着重要作用。然而,在植物致病真菌中,关于DNA损伤及DNA损伤介导的细胞自噬研究较少,作用分子机制尚不清楚。本研究通过AIM（Atg8 interact motif Atg8互作模体）结构域预测,找到两个潜在的可能影响自噬的基因Mo RAD26和Mo MEC1。根据同源重组原理,在稻瘟病菌中将这两个基因进行了敲除,并对基因缺失突变菌株进行了生物学表型的初步考察。试验结果显示,Mo RAD26基因缺失后,稻瘟病菌的生长、产孢及附着胞的形成未受到影响,但是对寄主的致病力显着减弱,进一步分析发现Mo RAD26缺失后稻瘟病菌的侵染栓形成受到抑制,侵染菌丝扩展存在缺陷,对H2O2、HU（Hydroxyurea羟基脲）和MMS（Methyl Methanesulfonate甲磺酸甲酯）更加敏感。此外,在缺氮饥饿条件下,Mo RAD26缺失后稻瘟病菌的自噬水平略有升高。Mo MEC1基因缺失后,稻瘟病病菌生长显着减缓、产孢量明显下降、附着胞形成滞后、对H2O2更加敏感,HU和MMS处理后,稻瘟病菌生长被完全的抑制,但是通过喷雾接种发现Mo MEC1缺失后稻瘟病菌的致病力略有降低。使用HU和缺氮处理,通过Western blot检测Mo MEC1缺失后稻瘟病菌的自噬水平,发现在DNA损伤前提下,ΔMomec1的细胞自噬相对野生型显着上升;在缺氮条件下,ΔMomec1的自噬水平略有升高。本文初步探究了两个AIM结构域蛋白Mo Rad26和Mo Mec1在稻瘟病菌中的功能,明确了其在稻瘟病菌基因组稳定和细胞自噬过程中起重要作用,为稻瘟病菌的防治提供理论依据。此外,也为其它丝状真菌DNA损伤与细胞自噬相关的研究提供借鉴。
齐雅平[4]（2021）在《基于DNA分子水平预测放射生物效应的机制模型的研究及应用》文中研究说明质子放射治疗因质子具有优越的布拉格峰特性而逐渐成为除了光子放疗之外的另一种新兴技术。临床中将质子与光子间的相对生物效应（Relative Biologi-cal Effectiveness,RBE）用常数 1.1 来表示,然而越来越多生物实验表明 RBE 不是一个常量,其值受多种如传能线密度（Linear Energy Transfer,LET）等物理和生物相关参数影响。目前常见的RBE模型大多是基于线性二次方程发展而来的现象学模型,它们基于细胞存活这一生物终端,只能表明高LET粒子对细胞杀伤力强,不能给出可变RBE的潜在机制的信息,而且通常由于实验数据存在较大噪声致其无法在临床上广泛应用。从生物机理上讲,细胞杀伤是DNA损伤和修复作用的结果,特别是辐射诱导的DNA双链断裂（Double Strand Breaks,DSB）已被证实可产生细胞毒性。基于纳剂量和DNA分子水平的机械模型可以通过模拟DSB的诱导和修复过程来可以揭示其生物机制。因此,基于作者已发表的三篇学术论文内容,本博士论文的研究目的是以一种从生物分子的微观角度到个体的宏观角度的指导思路,基于蒙特卡罗工具分别从DNA分子损伤和修复水平构建不同生物终端的RBE预测的机械模型,来评估接受辐射后的个体的放射生物效应,并将该模型用于放射治疗计划系统,进行治疗计划的生物优化,为辐射生物效应与辐射物理剂量之间搭建桥梁。为实现该目的,本博士课题分为以下四个研究任务:（1）构建常氧条件下正常组织G1/G0细胞周期DNA分子水平辐射损伤数据;（2）根据DNA损伤数据构建DSB修复动力学模型;（3）运用模拟的生物终端参数,构建不同生物终端的RBE模型;（4）通过蒙特卡罗方法计算病人体内剂量与LET分布,将RBE模型用于临床放射生物效应的预测。本文首先分别从物理和生物两个方面对放射生物效应的背景知识进行了介绍,包括宏观物理剂量和纳米剂量的定义和应用,以及辐射损伤修复机制。然后通过蒙特卡罗工具Geant4-DNA和DaMaRiS软件逐步模拟获得DNA损伤数据和非同源末端连接（Non-Homologous End Joining,NHEJ）修复路径选择,并与37组文献中实验数据进行对比,验证模型合理性。基于以上结果建立了以初始DSB、修复24小时后未修复DSB、错修复DSB以及未/错修复组合DSB产额为不同生物终端的四种RBE模型,并基于一个临床扩展布拉格峰（Spread Out Bragg Peak,SOBP）射束在水箱中的物理剂量和LET分布计算RBE值,与365组文献中基于细胞存活实验数据的RBE结果进行对比。通过接口将RBE模型用于质子放疗计划的生物参数优化。结果发现:蒙特卡罗径迹结构方法计算的DNA单链断裂（Single Strand Breaks,SSB）产额、DSB产额以及二者比值结果与文献中细胞实验测量值和模拟值结果基本符合,且最为关键的DSB产额与随着LET值升高而呈线性上升;构建的融合了 DSB末端切除相关的NHEJ精细修复模型（交叉修复模型）预测的未修复DSB产额与八种辐射条件下的大部分实验结果吻合,并且关键修复蛋白敲除后该模型表现出良好的鲁棒性,能解释切除相关修复过程的机制;通过60组不同LET数值的质子辐射条件建立LET值与模型产生预测24小时后错修复DSB份额建立了二次多项式函数关系,未修复DSB产额占初始DSB产额的比值则不随LET值变化,始终保持在5.28%;四种生物终端RBE预测值与文献中实验所得RBE值相比,基于错修复DSB产额的RBE模型的绝对值高两个数量级。基于初始DSB、未修复DSB以及未/错修复DSB组合的RBE模型的相对值在不同细胞存活率的实验RBE值范围内;应用本文发展的以上两种具有合理解释的生物终端RBE模型应用在一例鼻咽癌患者治疗计划中,验证了模型的适用性。综上,本课题成功地将放疗计划中的常用的物理参数与多尺度的生物终端结果建立了关联,为临床工作的生物优化提供了有价值的多角度参考。
马淑云[5]（2021）在《DNA-PK-AKT信号通路通过增强微管动态变化促进DNA损伤修复》文中进行了进一步梳理基因组的不稳定性与发育缺陷、过早衰老、慢性病、癌症以及抗感染能力下降均具有密切的关系。因此,保证基因组的稳定性对于维持人类健康具有重要的作用。人体内或者所生存的外部环境中存在着各种各样的不利因素使细胞内基因组DNA发生不同类型的损伤,比如双链和单链断裂、碱基损伤等,进而导致基因组不稳定。DNA断裂位点精准、高效的修复对于保证基因组稳定性具有非常重要的作用。在生物体内,DNA双链断裂（DSBs）是最常见的DNA损伤方式。DSBs主要由非同源末端连接（c-NHEJ）和同源重组（HR）两种方式进行修复。当DNA损伤发生之后,DSBs位点以及其周围染色体的移动性会增加,保证两个断裂末端之间能够快速的相遇以及被修复。因此,DNA双链断裂末端的高效移动性对于DSBs能够被快速高效的修复具有至关重要的作用。尽管目前的研究表明,微管的动态变化可以调控DNA断裂末端的运动,但是,当DNA双链断裂发生之后,DSB是通过什么途径诱导微管的动态变化进而反过来调控DNA双链断裂损伤的修复仍然是个未解之谜。通过大量的实验探索,我们发现了一种新的DNA双链断裂诱导的微管应激机制（DMSR）—DSBs诱导中心体成熟以及微管成核和延伸能力增强,进而促进DSBs运动性和c-NHEJ修复。DNA双链断裂导致中心体对中心粒外周蛋白（PCM）的募集,特别是PCNT（Pericentrin）,γ-tubulin,NEDD1等。随着PCM的募集,中心体成熟,中心体成核能力增强,从而促进DSBs运动性的增加以及c-NHEJ修复过程的发生。此外,DNA双链断裂促进的中心体成熟主要发生在细胞静止期（G1）和间期（G0）,并且依赖于DNA-PK-AKT信号通路,而不是传统的有丝分裂细胞时期中促进中心体成熟的PLK1蛋白激酶。当敲除中心体蛋白之后,DMSR和DSBs运动性会极大的减弱,进而导致c-NHEJ修复进程延迟。而且DMSR仅仅持续6-8h左右。当敲除c-NHEJ关键蛋白DNA-PK或者53BP1之后,DMSR现象则会消失。综上所述,我们的研究揭示了一种新的正向调控DNA损伤修复机制:在G1或者G0期的细胞中,DSBs可以促进中心体和微管的动态变化进而促进c-NHEJ修复途径。
丘妙韵[6]（2021）在《circRNA057504在苯并[a]芘致人支气管上皮细胞DNA损伤中的功能及机制研究》文中研究说明背景与目的苯并[a]芘（Benzo[a]pyrene,B[a]P）是多环芳烃类致癌物的典型代表物质,广泛分布于自然环境及职业环境中。苯并[a]芘生成量大、分布范围广、易于在生物体内富集、致癌性强,国际癌症研究中心将其认定为Ⅰ类致癌物。苯并[a]芘进入生物体内后经一系列酶的催化生成活性代谢物二羟环氧苯并芘[a]（BPDE）,可与DNA相互作用形成BPDE-DNA加合物,引起DNA碱基突变、双链断裂等遗传损伤,损伤累积可诱发癌变。研究表明苯并[a]芘除具有致突变、致癌、致突变等遗传学损伤效应外,还可同时引起一系列表观遗传学改变。随着对表观遗传学深入研究,环状RNA（circularRNA,circRNA）是表观遗传学中新兴的研究焦点,其共价闭合的环状结构决定其具有高稳定性的特点,近年来其生物学功能也被不断地揭示,多项研究表明环状RNA在化学物暴露相关疾病发生发展中发挥关键作用,环状RNA可通过结合miRNAs或功能蛋白等机制发挥调控作用。本课题组此前多项研究表明环状RNA在化学物诱导癌症或其他疾病发生中具有重要的调控作用。遗传学损伤是癌变早期中的关键环节,然而目前有关环状RNA与遗传损伤作用关系的研究尚未报道。因此本研究旨在通过苯并[a]芘暴露人支气管上皮细胞构建DNA损伤模型,研究环状RNA在苯并[a]芘致DNA损伤过程中的功能与分子机制,以探索表观遗传学与遗传学间的相互关系,进而深入探索化学物暴露诱导癌症发生及发展的机制。方法1.细胞实验以不同浓度的苯并[a]芘暴露16HBE和BEAS-2B细胞,通过cck-8测定细胞活力水平,ELISA检测细胞活性氧水平,中性彗星实验、Western Blot实验及免疫荧光实验评价DNA损伤水平,以验证苯并[a]芘暴露致人支气管上皮细胞DNA损伤模型的成功构建。2.相对定量qRT-PCR检测基因表达使用Go Script TMReverse Transcription System进行逆转录实验,通过实时荧光定量PCR检测基因的相对表达量。3.circRNA功能实验构建circRNA05754干扰/过表达研究体系,检测circRNA05754敲减或过表达后对苯并[a]芘暴露致人支气管上皮细胞DNA损伤水平的影响。4.小鼠体内实验利用本课题组此前成功构建的苯并[a]芘暴露BALB/c小鼠模型,取小鼠肺部组织冻存样本,提取RNA,检测circRNA及相关基因的表达情况;提取小鼠肺组织蛋白质,检测DNA损伤相关蛋白及circRNA结合蛋白的表达水平。5.DNA甲基化检测全基因组提取后进行亚硫酸氢盐转化,使用MS-PCR检测苯并[a]芘暴露后circRNA057504亲本基因甲基化水平变化。6.RNA pulldown实验通过RNA-pull down实验联合WB实验结果分析,确定与环状RNA057504与靶向蛋白的结合作用。7.免疫共沉淀实验以NONO为诱饵蛋白通过免疫共沉淀实验下拉蛋白异源二聚体,通过凝胶电泳鉴定产物。8.统计分析使用SPSS软件对实验数据进行统计分析,实验数据重复至少三次,采用t检验和方差分析进行显着性差异统计分析,p<0.05为差异具有统计学意义。结果1.苯并[a]芘暴露致人支气管上皮细胞DNA损伤苯并[a]芘暴露后细胞活性氧水平升高,γ-H2AX蛋白表达水平升高,焦点增多,细胞彗星尾部DNA含量增高,尾距增长,拖尾现象明显,即苯并[a]芘暴露后引起人支气管上皮细胞DNA损伤水平显着上升。2.circRNA057504在苯并[a]芘致人支气管上皮细胞DNA损伤中高表达苯并[a]芘暴露致人支气管上皮细胞circRNAs表达谱改变;circRNA057504在苯并[a]芘暴露后的16HBE和BEAS-2B细胞中呈现稳定高表达,且circRNA057504具有环状RNA一般结构特征。3.circRNA057504促进苯并[a]芘致人支气管上皮细胞DNA损伤构建circRNA057504稳定干扰及过表达细胞株联合苯并[a]芘暴露,发现敲低circRNA057504可显着降低苯并[a]芘暴露引起的细胞DNA损伤水平,而过表达circRNA057504可明显促进苯并[a]诱导的细胞DNA损伤水平。4.苯并[a]芘暴露通过抑制甲基化转移酶DNMT3A表达调控TMEM194B表达水平苯并[a]芘暴露人支气管上皮细胞后引起甲基化转移酶DNMT3A低表达,MS-PCR实验结果表明苯并[a]芘暴露引起circRNA57504的亲本基因TMEM194B DNA甲基化水平降低,而TMEM194B和circRNA57504表达水平升高。5.circRNA057504通过靶向NONO和SFPQ蛋白参与细胞DNA损伤过程circRNA057504可以直接靶向并反向调控NONO和SFPQ蛋白表达,CO-IP结果表明苯并[a]芘暴露致细胞DNA损伤过程中具有NONO-SFPQ蛋白复合体参与,且干扰circRNA057504可促进NONO和SFPQ形成蛋白复合体。6.动物实验验证苯并[a]芘暴露后可诱导小鼠肺部组织γ-H2AX蛋白水平升高,TMEM194B DNA甲基化水平降低,circRNA057504表达升高,NONO和SFPQ蛋白表达水平降低。结论1.苯并[a]芘暴露诱导16HBE和BEAS-2B细胞DNA损伤。2.circRNA0057504促进苯并[a]芘诱导的16HBE和BEAS-2B细胞DNA损伤水平。3.苯并[a]芘暴露通过抑制甲基化转移酶DNMT3A表达水平诱导circRNA057504亲本基因TMEM194B高表达。4.苯并[a]芘暴露致人支气管上皮细胞DNA损伤过程中,circRNA057504特异性靶向NONO及SFPQ,调控NONO-SFPQ形成蛋白复合物参与DNA损伤修复过程。
张晗[7]（2021）在《CircRNA005962在炭黑纳米颗粒致呼吸道上皮细胞DNA损伤中的功能及机制研究》文中研究指明背景与目的炭黑是指在燃料发生不完全燃烧时的产物,目前已被列入国际癌症研究机构组织的2B类致癌物质中。炭黑颗粒在药理学中的毒性破坏作用力与它们颗粒的尺寸大小紧密相关。与传统的微米级炭黑颗粒环境化学物相比,纳米级的炭黑颗粒所诱导的细胞受到损伤较为严重。研究证据表明炭黑纳米颗粒不仅可以引起细胞毒性、加重人类呼吸系统疾病,甚至可以造成DNA链损伤。环状RNA是非编码RNA的研究热点,大量研究表明,在化学物暴露所致机体健康效应中,环状RNA发挥重要调控功能。因此探讨circ RNA在炭黑纳米颗粒致DNA损伤机制中的作用,可以从表观遗传学层面更深入地阐述并揭示炭黑纳米颗粒引起的致病机制。建立接近环境实际暴露水平的炭黑纳米颗粒致呼吸道上皮细胞DNA损伤模型,寻找功能circ RNA并探讨其在炭黑纳米颗粒致人呼吸道上皮细胞DNA损伤中的分子机制。方法采用TEM对炭黑纳米的颗粒物表征进行鉴定。根据颗粒物实际暴露阈值、颗粒物在肺内沉积的相关文章以及MPPD软件模型等数据进行了折算,确定了体外细胞模型及体内动物模型构建的暴露剂量。选择16HBE、BEAS-2B细胞和BALB/c小鼠作为研究对象,体外实验构建了炭黑纳米颗粒导致DNA损伤的模型,通过CCK-8、LDH和ROS实验检测细胞的活力及氧化应激水平。通过ELISA、Western Blot、中性彗星实验来检测8-OHd G、γ-H2AX、DNA双链断裂等DNA损伤指标。体内实验中运用Western blot和q-PCR,评估炭黑纳米颗粒暴露小鼠肺部DNA损伤发生情况。通过高通量测序结合q-PCR挑选差异circ RNA。构建circ RNA干扰、过表达的研究体系,联合炭黑纳米颗粒暴露,通过流式细胞术、ELISA、Western Blot、免疫荧光、中性彗星实验等方法进行实验,检测到circ RNA005962表达改变对人支气管上皮细胞的细胞周期、ROS、8-OHd G及γ-H2AX等DNA损伤指标的影响。通过RNA pulldown实验确定circ RNA005962特异性结合蛋白,并在联合炭黑纳米颗粒暴露下,通过Western Blot及q-PCR对三者之间的互作关系进行验证。结果炭黑纳米颗粒在溶液中为纳米粒径,DLS为258.84±3.34nm,Zeta电位为-57.54±0.44。体外实验结果显示,炭黑纳米颗粒可以抑制细胞活力、诱导细胞ROS水平升高及DNA氧化损伤发生,且炭黑纳米颗粒引起的DNA损伤水平随染毒浓度的增加而升高。体内实验结果表明,无论在低暴露组还是在高暴露组,炭黑纳米颗粒均能引起小鼠DNA损伤发生,高暴露组DNA损伤水平更为严重。circ RNA005962在炭黑纳米颗粒暴露组中呈现高表达。circ RNA005962干扰联合炭黑纳米颗粒暴露后,DNA损伤水平较对照组升高;过表达circ RNA005962联合炭黑纳米颗粒暴露,DNA损伤水平较对照组降低,表明circ RNA005962在炭黑纳米颗粒致支气管上皮细胞DNA损伤反应中发挥调控作用。RNA pulldown实验证明circ RNA005962可与RNA结合蛋白FUS直接结合,并受FUS正向调控;circ RNA005962可结合DNA修复蛋白LIG4。干扰、过表达circ RNA005962后联合炭黑纳米颗粒暴露后,circ RNA005962可正向调控LIG4水平,进一步证实circ RNA005962在DNA损伤过程中发挥调控功能。结论1、CBNPs可以引起人支气管上皮细胞以及小鼠肺部的DNA损伤,在此过程中circ RNA005962发挥促修复基因的功能。2、在CBNPs致人支气管上皮细胞DNA损伤过程中,circ RNA005962与FUS直接结合并受其正向调控;同时circ RNA005962与LIG4直接结合并正向调控其表达,进而调控DNA损伤。
张冲[8]（2021）在《苯肾上腺素上调ARP3减轻颌下腺DNA辐射损伤》文中认为目的:放射治疗是头颈癌的重要治疗措施,但头颈部放疗可严重损伤放射野内的正常组织,尤其是对放射极其敏感的唾液腺。DNA是电离辐射损伤组织细胞的重要靶点,辐射引发细胞氧化应激可致DNA双链断裂,危及基因组稳定性,最终引起细胞凋亡。肌动蛋白相关蛋白2/3复合体（actin-related protein 2/3complex,ARP2/3）可在细胞核内促进微丝聚合,为断裂DNA的修复提供动力,ARP3是ARP2/3复合体的重要组成亚基,其在颌下腺的辐射损伤中的作用尚不清楚。我们前期研究表明苯肾上腺素（phenylephrine,PE）预处理可降低辐射引发的颌下腺细胞氧化应激水平,维持颌下腺线粒体的稳态平衡,从而减轻颌下腺辐射损伤,但PE对辐射损伤颌下腺DNA的作用尚无报道。因此,我们将探索PE与ARP3在颌下腺DNA辐射损伤中的作用。材料和方法:（1）体外实验:使用大鼠颌下腺SMG C6细胞系进行实验,共分为4组:空白对照组、单纯PE组（使用PE 10μM孵育细胞）、单纯辐射组（给予细胞2.5 Gy、5 Gy、10 Gy和15 Gy X线辐射）和PE预处理组（使用PE 10μM在X线辐射前0.5 h孵育细胞）。使用ROS荧光探针检测辐射前后以及苯肾上腺素处理前后的细胞ROS水平,免疫印迹法检测DNA双链断裂的标志物γH2AX以及ARP3蛋白的表达水平,细胞免疫荧光检测ARP3在颌下腺细胞内的定位及表达情况。（2）体内实验:将24只Wistar大鼠随机分为四组（每组6只）:空白对照组、单纯PE组（腹腔注射PE 5 mg/kg）、单纯辐射组（大鼠颌下腺区域给予X线辐射20 Gy）和PE预处理组（辐射前1 h腹腔注射PE 5 mg/kg）。在辐射后第7天取颌下腺组织,提取大鼠颌下腺总蛋白后进行质谱检测,同时制作石蜡切片,检测ARP3蛋白在各组颌下腺组织中的表达分布。结果:（1）体外实验:细胞ROS检测结果显示,在10 Gy X线辐射后1 h,单纯辐射组与空白对照组相比,细胞ROS水平升高168.66%（P<0.05）;PE预处理组与单纯辐射组相比,细胞ROS水平降低108.44%（P<0.05）。Western blot检测γH2AX蛋白实验结果显示,单纯辐射组相较于空白对照组,2.5 Gy、5 Gy、10 Gy和15 Gy的X线在辐照后1 h分别将SMG C6细胞γH2AX蛋白水平提高了185.44%（P<0.05）、552.51%（P<0.05）、590.49%（P<0.05）和972.71%（P<0.05）;苯肾上腺素预处理将各组γH2AX蛋白水平降低了146.67%（P<0.05）、389.68%（P<0.05）、247.25%（P<0.05）和419.79%（P<0.05）。细胞免疫荧光结果显示,ARP3蛋白在大鼠颌下腺细胞的细胞质及细胞核内都有分布。Western blot检测SMG C6细胞核中ARP3蛋白实验结果显示,在10 Gy X线辐射后4 h,核内ARP3的表达水平比空白对照组降低了9.83%（P<0.05）;而PE预处理使辐射后SMG C6细胞核中的ARP3蛋白表达水平比单纯照射组提高了12.85%（P<0.05）。（2）体内实验:蛋白质组学结果表明,单纯辐射组与空白对照组相比,ARP3蛋白的表达水平降低了31.71%（P<0.05）;PE预处理组与单纯辐射组相比,ARP3蛋白的表达水平增加9.42%（P<0.05）。免疫组化结果表明,ARP3蛋白在大鼠颌下腺组织内表达,主要分布于导管细胞和颗粒曲管内,ARP3在单纯辐射组的表达水平较空白对照组下降48.9%（P<0.05）,而使用苯肾上腺素预处理可将辐射组ARP3表达水平提高31.7%（P<0.05）。结论:苯肾上腺素对辐射导致的DNA损伤具有保护作用,其机制可能与激活细胞核内ARP3促进DNA损伤修复以及减轻颌下腺细胞氧化应激有关。本研究将为明确唾液腺辐射损伤的机制提出新的作用靶点,同时为促进苯肾上腺素作为防治唾液腺辐射损伤的药物提供更多的实验及理论依据。
庄浩瀚[9]（2021）在《弓形虫致密颗粒蛋白GRA16抑制宿主细胞DNA损伤修复机制研究》文中认为弓形虫（Toxoplasma gondii）是世界性分布的单细胞专性寄生虫,感染人在内的几乎所有温血动物,其广泛传播不仅引起畜牧业的经济损失,也造成流行区域公共卫生安全风险。弓形虫感染宿主后可引起慢性感染,以缓殖子组成的休眠包囊寄生于宿主体内,当宿主免疫低下时,休眠包囊活化,弓形虫以速殖子的方式开始增殖,引起急性感染,严重情况下造成宿主死亡。目前虽然有药物可以控制弓形虫的急性感染,但尚未有药物可以根除宿主体内的休眠包囊。弓形虫毒力蛋白的生物学功能研究以及宿主互作机制研究是防控弓形虫感染的重要基础,弓形虫感染引起宿主细胞发生多种生理过程变化,包括细胞周期调控、细胞自噬和细胞凋亡等,宿主细胞的生理变化和弓形虫的增殖密切相关,但是弓形虫感染后宿主细胞DNA损伤的研究少见报道。细胞核DNA是遗传稳定的决定因素,而且其转录及翻译后的产物,比如RNA和蛋白质,是细胞进行各种生理过程的必需元件,因此宿主细胞DNA损伤和损伤修复的分子机制是研究弓形虫与宿主互作机制的重要组成部分。本研究首先确认了弓形虫感染引起体外培养细胞发生DNA损伤,证实活性氧自由基（Reactive oxygenspecies,ROS）是宿主细胞发生DNA损伤的重要因素;随后,本研究探究了弓形虫毒力蛋白对宿主细胞DNA损伤的影响,发现致密颗粒蛋白GRA16在细胞DNA损伤修复过程中显着减弱DNA损伤标志物γH2AX表达,阻碍DNA损伤修复过程;最后,本研究证实GRA16通过加速γH2AX去磷酸化来减弱γH2AX表达,推断PPM1D磷酸酶是γH2AX去磷酸化过程中的关键蛋白。1.弓形虫感染引起宿主细胞DNA损伤将弓形虫感染293T、HeLa和Vero细胞（MOI=10）,分别在0h（未感染）、10h、20 h和30 h取样,通过免疫印迹和免疫荧光检测宿主细胞DNA双链断裂损伤标志物γH2AX的表达水平。结果显示,与未被感染的细胞相比,弓形虫感染的3种细胞大量表达γH2AX,且随着感染时间的延长,γH2AX表达量增加,表明弓形虫感染可引起宿主细胞发生DNA双链断裂损伤。本研究随后探究了这种DNA损伤发生的可能原因,结果显示DNA损伤和宿主细胞凋亡无关;当弓形虫感染被血清封闭限制时,宿主DNA损伤程度明显下降,说明宿主DNA损伤发生依赖于弓形虫成功进入宿主细胞内建立感染;与未被感染的细胞相比,弓形虫感染的细胞ROS水平显着升高,ROS抑制剂NAC（N-acetylcysteine）处理降低宿主细胞的ROS水平并显着抑制感染后宿主细胞的γH2AX表达,说明ROS是弓形虫引起宿主细胞DNA损伤的重要因素。最后,通过免疫印迹检测了 DNA双链断裂损伤反应（DNA damageresponse）信号通路的关键蛋白ATM和CHK2,结果显示ATM/CHK2信号通路在弓形虫感染中后期被激活,提示弓形虫感染引起的宿主细胞DNA损伤可能通过激活的ATM/CHK2信号通路参与了宿主细胞周期调控等生理进程。2.弓形虫致密颗粒蛋白GRA16减弱γH2AX表达并阻碍宿主细胞的DNA损伤修复进程病原体分泌毒素或者特定毒力蛋白调控宿主细胞DNA损伤的现象普遍存在,弓形虫是否具有调控宿主细胞DNA损伤的毒力蛋白?有报道弓形虫致密颗粒蛋白GRA16定位于宿主细胞核并且和宿主磷酸酶PP2A结合紧密,PP2A磷酸酶参与了 γH2AX去磷酸化转变为组蛋白H2AX的过程,因此本章研究探究了 GRA16对宿主DNA损伤的影响。通过真核表达系统在293T细胞里过表达GRA16,免疫荧光结果显示过表达GRA16未能诱导细胞表达γH2AX,提示GRA16无法诱导细胞发生DNA损伤;GRA16无法诱导细胞发生DNA损伤,但GRA16是否参与了细胞的DNA损伤修复过程呢?本章研究运用喜树碱诱导293T细胞发生DNA损伤和损伤修复过程,实验结果显示过表达GRA16的293T细胞在DNA损伤修复过程中显着减弱了 γH2AX的表达,γH2AX的表达和细胞DNA损伤和损伤修复紧密相关,提示GRA16虽然未能诱导细胞发生DNA损伤,但是GRA16可能参与了细胞的DNA损伤修复过程;本章研究随后运用CRISPR-CAS9系统敲除弓形虫GRA16蛋白,与对照弓形虫感染的宿主细胞相比,GRA16缺失弓形虫感染的宿主细胞在感染早期高量表达γH2AX,进一步证实GRA16具有减弱宿主细胞γH2AX表达的功能;最后,通过彗星实验检测GRA16减弱γH2AX表达对细胞DNA损伤修复的影响,实验结果显示过表达GRA16的细胞在喜树碱诱导的DNA损伤修复过程中呈彗星拖尾状,提示GRA16阻碍了细胞的DNA损伤修复进程。3.宿主细胞磷酸酶PPM1D参与GRA16加速γH2AX的去磷酸化过程γH2AX的表达量在DNA损伤和修复过程中处于动态平衡,当DNA发生双链断裂损伤时,组蛋白H2AX磷酸化转变为yH2AX,当DNA损伤修复完成时,γH2AX去磷酸化转变为组蛋白H2AX。因此,GRA16减弱γH2AX表达并阻碍宿主细胞的DNA损伤修复进程有2种可能:1)GRA16抑制组蛋白H2AX磷酸化转变为γH2AX,2)GRA16加速γH2AX去磷酸化转变为组蛋白H2AX。本章研究通过免疫荧光结果证实过表达GRA16的HeLa细胞在DNA损伤早期正常表达γH2AX,后期γH2AX表达逐渐减少,提示GRA16并未抑制γH2AX的形成过程,而是加速了 γH2AX的去磷酸化过程;本章研究随后运用真核表达系统构建与磷酸酶PP2A无法结合的截短GRA16（1-237aa）蛋白,与全长GRA16（1-505 aa）蛋白相比,截短GRA16（1-237aa）依然保留了减弱γH2AX表达的功能,提示GRA16与磷酸酶PP2A的结合并未影响GRA16减弱γH2AX表达的过程;本章研究接着运用荧光实时定量PCR筛选参与γH2AX去磷酸化的3个磷酸酶（PPM1D、PPM1G和PP2A）,结果显示在喜树碱诱导的DNA损伤和损伤修复过程中,磷酸酶PPM1D在过表达GRA16的细胞里呈早期低、中期高、后期低的表达趋势,符合同期γH2AX的变化趋势,提示PPM1D可能参与了 GRA16加速γH2AX去磷酸化的过程;最后,本章研究运用CRISPR-CAS9系统敲除HeLa细胞的PPM1D蛋白,与对照细胞相比,GRA16在PPM1D缺失细胞里减弱γH2AX表达的能力显着降低,进一步验证磷酸酶PPM1D参与了 GRA16加速γH2AX去磷酸化的过程。综上所述,本研究从DNA损伤的角度探究了弓形虫感染对宿主细胞造成的生理变化,结果显示弓形虫感染引起宿主细胞发生DNA损伤,活性氧是宿主细胞DNA损伤的重要影响因素;弓形虫致密颗粒蛋白GRA16具有减弱宿主DNA损伤标志物γH2AX表达的功能,并阻碍了细胞的DNA损伤修复;GRA16通过加速γH2AX去磷酸化过程以减弱宿主细胞的γH2AX表达,磷酸酶PPM1D参与了 GRA16加速γH2AX去磷酸化的过程。本研究探索了弓形虫感染引起宿主DNA损伤的可能因素,探究了弓形虫致密颗粒蛋白GRA16对宿主DNA损伤的调控方式,研究内容有助于进一步理解弓形虫与宿主的互作方式,为更好地防治弓形虫提供理论基础。
刘真真[10]（2020）在《冰岛硫化叶菌CRISPR激活蛋白Csa3a对DNA损伤修复调控的研究》文中认为CRISPR-Cas（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats and CRISPR-associated genes）是原核生物抵御外源入侵遗传元件的获得性免疫系统。CRISPR-Cas系统行使免疫功能受到转录因子、信号分子等严格的调控。在冰岛硫化叶菌（Sulfolobus islandicus）REY15A中,CRISPR-Cas系统关联转录因子Csa3a可触发CRISPR-Cas系统原发免疫适应（de novo spacer acquisition）,获取新间隔序列（spacer）,并激活CRISPR RNA转录以获得免疫力。在该基础上,本研究聚焦CRISPR激活蛋白Csa3a对DNA损伤响应（DDR）系统的调控研究,得到如下结果:（1）根据转录组与报告基因数据,本研究发现缺失csa3a基因后DDR基因转录表达均发生了下调,包括在冰岛硫化叶菌中响应UV诱导DNA损伤的ups和ced操纵子,以及cdc6-2和tfb3等转录调控蛋白基因。（2）凝胶阻滞实验和表面等离子体共振实验结果表明Csa3a蛋白特异性地结合上述DDR基因的启动子,结合转录组数据揭示了Csa3a蛋白对这些基因的转录激活作用。（3）光学显微镜观察结果表明,与野生型菌株相比,缺失csa3a基因可显着抑制在DNA损伤剂处理情况下由Ups系统介导的细胞聚集,降低csa3a缺失菌株的存活率。流式细胞术分析表明csa3a缺失株对DNA损伤剂更敏感,细胞更易产生DNA碎片。（4）Ced系统介导的DNA修复实验结果表明,Ced系统可修复CRISPR干涉cas5基因导致的基因组DNA损伤,且缺失csa3a基因可显着降低修复效率。综上所述,本研究揭示了Csa3a蛋白介导的CRISPR-Cas系统与DNA损伤修复之间的相互关系,为进一步研究CRISPR-Cas系统自身免疫与维持基因组稳定性之间的联系奠定了基础。
二、DNA损伤与修复（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、DNA损伤与修复（论文提纲范文）
（1）DNA损伤与修复在食管癌中的研究进展（论文提纲范文）
| 1 DNA损伤与修复反应 |
| 2 DNA损伤与修复相关癌突变信号 |
| 2.1 与年龄相关信号 |
| 2.2 DNA修复途径缺陷相关信号 |
| 2.3 APOBEC相关信号 |
| 2.4 吸烟相关信号 |
| 2.5 紫外线相关信号 |
| 3 食管癌相关的DNA损伤 |
| 3.1 ESCC相关的DNA损伤研究 |
| 3.1.1 DNA损伤修复与ESCC放射敏感性 |
| 3.1.2 DNA损伤反应调控，促进ESCC化疗敏感性 |
| 3.1.3 DNA损伤修复应答与ESCC耐药性 |
| 3.2 EAC相关的DNA损伤研究 |
| 4 展望 |
（2）电离辐射诱导非小细胞肺癌DNA损伤与线粒体功能紊乱的应答机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 肺癌现状与放射治疗 |
| 1.1.1 肺癌现状 |
| 1.1.2 肺癌放射治疗及综合治疗进展 |
| 1.2 DNA损伤形成及应答 |
| 1.2.1 DNA损伤在放射治疗中的形成 |
| 1.2.2 DNA损伤监督 |
| 1.2.3 DNA损伤识别修复 |
| 1.2.4 DNA损伤诱导的细胞死亡 |
| 1.3 线粒体功能紊乱 |
| 1.3.1 线粒体功能紊乱与癌症的形成和发展 |
| 1.3.2 线粒体与辐射抗拒性 |
| 1.3.3 Ras/PI3K/Akt/mTOR通路 |
| 1.3.4 线粒体翻译 |
| 1.4 DNA损伤应答和线粒体功能紊乱的相互作用 |
| 1.4.1 细胞核与线粒体之间的双向信号 |
| 1.4.2 DNA损伤应答与线粒体功能的共同调控通路 |
| 1.5 本文研究目的及意义 |
| 第2章 重离子诱导非小细胞肺癌复杂性DNA损伤的识别及修复 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与试剂 |
| 2.2.1 细胞来源 |
| 2.2.2 试剂及药品 |
| 2.2.3 主要使用仪器 |
| 2.3 实验方法与步骤 |
| 2.3.1 细胞培养传代 |
| 2.3.2 辐照与博来霉素处理 |
| 2.3.2.1 X射线辐照 |
| 2.3.2.2 碳离子辐照 |
| 2.3.2.3 博来霉素处理 |
| 2.3.3 细胞增殖检测CCK-8 实验 |
| 2.3.4 克隆形成实验 |
| 2.3.5 DNA凝胶电泳及DNA损伤频率的计算 |
| 2.3.6 免疫荧光试验 |
| 2.3.7 Western blot蛋白免疫印迹实验 |
| 2.3.8 数据统计分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 非小细胞肺癌对X射线和碳离子的辐射敏感性具有差异 |
| 2.4.2 X射线辐照及联合博来霉素对A549 细胞活性的影响 |
| 2.4.3 碳离子联合博来霉素诱导最明显的复杂DSB损伤 |
| 2.4.4 复杂DSA损伤的动态识别 |
| 2.4.5 复杂DNA损伤的主要修复方式可能为非同源末端连接(NHEJ) |
| 2.5 讨论 |
| 第3章 重离子联合替加环素诱导非小细胞肺癌线粒体功能紊乱的机理研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与试剂 |
| 3.2.1 细胞来源 |
| 3.2.2 试剂及药品 |
| 3.2.3 主要使用仪器 |
| 3.3 实验方法与步骤 |
| 3.3.1 细胞培养 |
| 3.3.2 辐照与替加环素处理 |
| 3.3.2.1 碳离子辐照 |
| 3.3.2.2 替加环素处理 |
| 3.3.3 克隆形成实验 |
| 3.3.4 免疫荧光实验 |
| 3.3.5 细胞凋亡实验 |
| 3.3.6 细胞内ATP检测 |
| 3.3.7 线粒体膜电势检测 |
| 3.3.8 线粒体内Ca~(2+)水平检测 |
| 3.3.9 Western blot蛋白免疫印迹实验 |
| 3.3.10 数据统计分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 碳离子、替加环素以及两者联合作用均能显着抑制肺癌细胞增殖 |
| 3.4.2 碳离子、替加环素以及两者联合作用均诱导线粒体功能紊乱 |
| 3.4.3 碳离子、替加环素及两者联合作用诱导细胞凋亡 |
| 3.4.4 碳离子、替加环素及两者联合作用在H1299 细胞中诱导自噬 |
| 3.4.5 碳离子通过Akt/AMPK/mTOR通路调控线粒体翻译蛋白 |
| 3.4.6 碳离子通过p53和Akt/AMPK/mTOR通路调控线粒体翻译蛋白 |
| 3.4.7 P53 缺失的H1299 细胞对线粒体翻译抑制更加敏感 |
| 3.5 讨论 |
| 第4章 DNA损伤与线粒体功能紊乱的共同应答通路 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与试剂 |
| 4.2.1 细胞来源 |
| 4.2.2 试剂及药品 |
| 4.2.3 主要使用仪器 |
| 4.3 实验方法与步骤 |
| 4.3.1 细胞培养 |
| 4.3.2 辐照与抑制剂处理 |
| 4.3.2.1 辐照 |
| 4.3.2.2 抑制剂处理 |
| 4.3.3 克隆形成实验 |
| 4.3.4 线粒体内Ca~(2+)水平检测 |
| 4.3.5 Western blot蛋白免疫印迹实验 |
| 4.3.6 数据统计分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 ATM抑制剂KU-55933 增加A549 细胞对碳离子的辐射敏感性 |
| 4.4.2 抑制ATM下调碳离子辐照后DSB损伤修复蛋白的表达 |
| 4.4.3 KU-55933 增加碳离子辐照后线粒体Ca~(2+)水平 |
| 4.4.4 ATM调控p53和mTOR参与碳离子辐照应答 |
| 4.4.5 自噬受ATM通路的调控参与碳离子应答 |
| 4.5 讨论 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文及研究成果 |
（3）稻瘟病菌MoRAD26和MoMEC1在DNA损伤修复及致病过程中的功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 水稻与稻瘟病 |
| 1.1.1 稻瘟病的危害与其研究意义 |
| 1.1.2 稻瘟病菌侵染循环 |
| 1.2 DNA损伤修复研究 |
| 1.2.1 DNA损伤与修复 |
| 1.2.2 DNA损伤应答信号传导 |
| 1.3 细胞自噬与DNA损伤 |
| 1.3.1 细胞自噬简介 |
| 1.3.2 AIM结构域蛋白的功能 |
| 1.3.3 自噬在稻瘟病菌侵染循环中的重要作用 |
| 1.3.4 DNA损伤介导细胞自噬的发生 |
| 1.4 本研究目的与意义 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 供试植物和菌株 |
| 2.1.2 菌株培养及保存条件 |
| 2.2 实验所需培养基 |
| 2.3 实验操作方法 |
| 2.3.1 目的基因敲除载体与回补载体构建 |
| 2.3.2 稻瘟病菌遗传转化及转化子验证 |
| 2.3.3 生物信息学分析 |
| 2.3.4 目的基因在不同时空的表达水平检测 |
| 2.3.5 稻瘟病菌致病力测定 |
| 2.3.6 稻瘟病菌基本表型考察 |
| 2.3.7 稻瘟病菌自噬检测 |
| 第三章 结果分析 |
| 3.1 稻瘟病菌MoRAD26 的基因功能研究 |
| 3.1.1 MoRad26 的生物信息学分析 |
| 3.1.2 MoRAD26 的时空表达 |
| 3.1.3 MoRAD26 缺失突变菌株及回补菌株的获得 |
| 3.1.4 MoRAD26 对稻瘟病菌的营养生长过程影响不显着 |
| 3.1.5 MoRAD26 参与调控稻瘟病菌的致病过程 |
| 3.1.6 MoRAD26 响应氧化胁迫 |
| 3.1.7 MoRAD26 响应DNA损伤胁迫 |
| 3.1.8 MoRAD26 影响稻瘟病菌自噬的发生 |
| 3.1.9 总结与讨论 |
| 3.2 稻瘟病菌MoMEC1 的基因功能分析 |
| 3.2.1 MoMec1 的生物信息学分析 |
| 3.2.2 MoMEC1 缺失突变体回补菌株的获得 |
| 3.2.3 MoMEC1 参与稻瘟病菌营养生长和产孢过程的调控 |
| 3.2.4 MoMEC1 的致病表型分析 |
| 3.2.5 MoMEC1 参与稻瘟病菌附着胞的调控 |
| 3.2.6 MoMEC1 响应氧化胁迫及DNA损伤胁迫 |
| 3.2.7 MoMEC1 负调控稻瘟病菌自噬发生 |
| 3.2.8 总结与讨论 |
| 第四章 全文总结与展望 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 本论文创新点 |
| 4.3 未来工作展望 |
| 参考文献 |
| 附录 A 本实验所需溶液配方 |
| 附录 B 本实验所用载体图谱 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（4）基于DNA分子水平预测放射生物效应的机制模型的研究及应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 放射生物效应简介 |
| 1.1.1 宏观物理剂量,微剂量和纳剂量 |
| 1.1.2 放射生物损伤与修复机制 |
| 1.2 放射生物效应预测模型 |
| 1.2.1 预测放射生物效应经验模型 |
| 1.2.2 基于蒙卡的分子水平放射生物效应预测模型 |
| 1.2.3 质子放疗RBE预测模型 |
| 1.3 论文主要研究内容 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 辐射诱导DNA损伤的计算 |
| 2.1.1 Geant4-DNA模拟原理 |
| 2.1.2 DNA以及细胞核几何模型 |
| 2.1.3 辐射条件及径迹结构模拟设置 |
| 2.1.4 DNA分子损伤的统计 |
| 2.2 DNA修复模型的构建 |
| 2.2.1 DaMaRiS工具原理概述 |
| 2.2.2 NHEJ中修复蛋白功能概述 |
| 2.2.3 修复路径的建模 |
| 2.2.4 模型验证的流程 |
| 2.3 模型的临床应用 |
| 2.3.1 构建不同生物学终点RBE模型 |
| 2.3.2 RBE模型用在SOBP照射水箱结果 |
| 2.3.3 RBE模型在治疗计划系统的应用 |
| 第3章 结果与讨论 |
| 3.1 辐射诱导DNA损伤结果 |
| 3.1.1 DNA辐射损伤产额结果 |
| 3.1.2 DNA辐射损伤模拟结果与文献结果对比 |
| 3.2 DNA修复模型的评估 |
| 3.2.1 修复模型中蛋白招募动力学结果 |
| 3.2.2 修复模型的整体修复动力学结果 |
| 3.2.3 特定蛋白质缺陷修复动力学结果 |
| 3.3 讨论DNA损伤修复模型结果的影响因素 |
| 3.3.1 利用MCDS软件分析氧含量的影响 |
| 3.3.2 DSB损伤复杂度对修复结果的影响 |
| 3.3.3 染色质环境对修复路径选择的影响 |
| 3.4 构建RBE模型 |
| 3.4.1 不同类别DSB修复结果 |
| 3.4.2 水模中不同终端RBE模型结果 |
| 3.4.3 对比四种RBE模型与文献结果 |
| 3.5 头颈部病例放疗计划的放射生物效应评估 |
| 第4章 总结与展望 |
| 4.1 总结 |
| 4.2 展望 |
| 参考文献 |
| 表1 名词缩写对照表 |
| 附录 A 60组不同能量和LET值模拟数据 |
| 附录 B SDD数据格式结构以及内容 |
| 附录 C DSB修复蛋白一览表 |
| 附录 D 文献中体外细胞实验的细胞系一览表 |
| 附录 E 修复动力学结果中修复蛋白招募动力学补充结果 |
| 附录 F 敲除蛋白后修复模型的招募动力学补充结果 |
| 附录 G 融合常染色质和异染色质结构的平行修复模型 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的研究成果 |
（5）DNA-PK-AKT信号通路通过增强微管动态变化促进DNA损伤修复（论文提纲范文）
| 本论文主要创新点 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 研究背景 |
| 1.1 DNA的损伤与修复 |
| 1.1.1 诱导DNA损伤产生的因素 |
| 1.1.2 DNA损伤修复途径简介 |
| 1.2 中心体与微管 |
| 1.2.1 中心体 |
| 1.2.2 微管 |
| 1.3 AKT背景简介 |
| 1.4 论文立题依据 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 常用细胞系及菌株 |
| 2.1.2 主要试验仪器 |
| 2.1.3 主要试验耗材 |
| 2.1.4 常用试剂盒 |
| 2.1.5 常用试剂 |
| 2.1.6 化学药物 |
| 2.1.7 抗体 |
| 2.1.8 siRNA和shRNA序列 |
| 2.1.9 荧光定量PCR引物 |
| 2.1.10 数据分析软件 |
| 2.2 实验相关试剂溶液的配制 |
| 2.2.1 常用实验试剂 |
| 2.2.2 免疫荧光相关试剂的配制 |
| 2.2.3 Western Blot相关溶液的配制 |
| 2.2.4 染色体核型分析相关试剂 |
| 2.2.5 细菌培养和核酸检测相关试剂的配置 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养,冻存与复苏 |
| 2.3.2 sh RNA载体的构建 |
| 2.3.3 感受态细胞的制备 |
| 2.3.4 慢病毒的包装和感染 |
| 2.3.5 si RNA转染,RNA的提取,荧光定量PCR(RT-qPCR) |
| 2.3.6 细胞周期的阻滞和分析 |
| 2.3.7 微管重生长实验 |
| 2.3.8 免疫荧光及荧光强度的定量分析 |
| 2.3.9 染色体核型分析 |
| 2.3.10 GFP-EB3微管动态分析 |
| 2.3.11 DNA双链断裂(DSBs)位点的移动性分析 |
| 2.3.12 核蛋白和细胞质蛋白的提取和蛋白免疫印迹 |
| 2.3.13 数据分析 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 DSBs促进G1期细胞微管的组装 |
| 3.1.1 DNA损伤促进微管的组装速度 |
| 3.1.2 DSBs促进微管的组装速度并且具有剂量和时间依赖性 |
| 3.2 DMSR促进G1期细胞中心体依赖的微管成核能力和组装能力 |
| 3.2.1 DMSR促进中心体依赖的微管数量增加 |
| 3.2.2 通过GFP-EB3定量分析DSBs诱导的微管成核和组装能力 |
| 3.3 DMSR只发生在G0和G1细胞时期 |
| 3.3.1 DMSR发生在G0期细胞中 |
| 3.3.2 DMSR不发生在S/G2期的细胞中 |
| 3.4 c-NHEJ损伤修复通路调控DMSR |
| 3.4.1 阻碍快速c-NHEJ途径的激活抑制DMSR的发生 |
| 3.4.2 c-NHEJ途径的持续活化导致DMSR持续发生 |
| 3.5 DSBs通过c-NHEJ途径中的信号通路诱导间期中心体的成熟 |
| 3.5.1 DMSR的发生依赖于DSBs诱导的间期中心体成熟 |
| 3.5.2 DMSR和间期中心体成熟不依赖PLK1和p38/MAPK |
| 3.5.3 DNA-PK调控DSBs诱导的间期中心体成熟 |
| 3.6 DMSR需要pT308AKT定位在中心体上 |
| 3.6.1 AKT调控间期中心体的成熟以及DMSR的发生 |
| 3.6.2 DSBs诱导细胞质中pT308AKT水平上调并且依赖于DNA-PK |
| 3.6.3 pT308AKT定位于中心体上 |
| 3.6.4 53BP1调控DNA-PK和pS2056DNA-PK在细胞质中的分布 |
| 3.7 DMSR和完整的中心体结构对c-NHEJ修复至关重要 |
| 3.7.1 DMSR促进DSBs末端的移动 |
| 3.7.2 DMSR促进c-NHEJ修复效率 |
| 3.7.3 干涉中心体蛋白影响基因组稳定性 |
| 第四章 实验总结与展望 |
| 4.1 实验总结 |
| 4.2 讨论与展望 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 博士期间已发表论文 |
| 致谢 |
（6）circRNA057504在苯并[a]芘致人支气管上皮细胞DNA损伤中的功能及机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 环状RNA与疾病相关性研究进展 |
| 参考文献 |
| 在校期间完成与发表的文章 |
| 在校期间获奖情况 |
| 致谢 |
（7）CircRNA005962在炭黑纳米颗粒致呼吸道上皮细胞DNA损伤中的功能及机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 非编码RNA与DNA损伤的研究进展 |
| 参考文献 |
| 在校期间完成与发表的论文 |
| 在校期间获奖情况 |
| 致谢 |
（8）苯肾上腺素上调ARP3减轻颌下腺DNA辐射损伤（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| (一)前言 |
| (二)材料和方法 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| (三)实验结果 |
| 1.苯肾上腺素缓解辐射后颌下腺细胞氧化应激 |
| 2.苯肾上腺素减轻颌下腺细胞DNA辐射损伤 |
| 3.苯肾上腺素增加辐射后颌下腺细胞ARP3蛋白表达 |
| (四)讨论 |
| (五)结论 |
| (六)参考文献 |
| 综述 放射性唾液腺炎中DNA损伤与修复研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
（9）弓形虫致密颗粒蛋白GRA16抑制宿主细胞DNA损伤修复机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 弓形虫概述 |
| 1. 弓形虫的生活史 |
| 2.弓形虫病的流行病学和诊断 |
| 3. 弓形虫病的治疗和疫苗研究进展 |
| 4. 本章小结 |
| 第二章 弓形虫的顶端复合体和致密颗粒蛋白GRA16研究进展 |
| 1. 弓形虫的顶端复合体 |
| 1.1 微线体和微线体蛋白 |
| 1.2 棒状体和棒状体蛋白 |
| 1.3 致密颗粒和致密颗粒蛋白 |
| 2. 致密颗粒蛋白GRA16研究进展 |
| 3. 本章小结 |
| 第三章 DNA损伤和DNA损伤修复 |
| 1. DNA损伤 |
| 2. DNA损伤修复 |
| 3. 病原感染与宿主DNA损伤及修复 |
| 4. 本章小结 |
| 本研究的目的和意义 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第四章 弓形虫感染引起宿主细胞发生DNA损伤 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞和弓形虫 |
| 2.1.2 实验试剂和耗材 |
| 2.1.3 实验设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 细胞复苏、培养和冻存 |
| 2.2.2 弓形虫复苏、培养和冻存 |
| 2.2.3 免疫印迹 |
| 2.2.4 免疫荧光 |
| 2.2.5 弓形虫感染封闭实验 |
| 2.2.6 活性氧自由基ROS检测 |
| 3. 结果 |
| 3.1 弓形虫感染引起宿主细胞DNA损伤 |
| 3.2 弓形虫引起的宿主细胞DNA损伤与细胞凋亡无关 |
| 3.3 宿主细胞DNA损伤依赖于弓形虫感染 |
| 3.4 活性氧自由基ROS检测 |
| 3.5 抑制ROS减弱宿主细胞DNA损伤信号γH2AX的表达 |
| 3.6 弓形虫感染激活ATM-CHK2信号通路 |
| 4. 讨论 |
| 5. 本章小结 |
| 第五章 弓形虫GRA16减弱γH2AX表达抑制宿主细胞DNA损伤修复 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞和弓形虫虫株 |
| 2.1.2 质粒载体 |
| 2.1.3 实验试剂和耗材 |
| 2.1.4 实验设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 细胞和弓形虫培养 |
| 2.2.2 提取弓形虫RNA |
| 2.2.3 逆转录cDNA |
| 2.2.4 克隆和质粒构建 |
| 2.2.5 质粒转染 |
| 2.2.6 喜树碱诱导细胞DNA损伤 |
| 2.2.7 免疫印迹 |
| 2.2.8 免疫荧光 |
| 2.2.9 弓形虫基因编辑 |
| 2.2.10 制备GRA16多克隆抗体 |
| 2.2.11 DNA损伤彗星实验 |
| 3. 结果 |
| 3.1 克隆和真核表达GRA16和ROP16 |
| 3.2 GRA16不能诱导细胞DNA损伤信号yH2AX表达 |
| 3.3 过表达GRA16减弱细胞DNA损伤信号γH2AX表达 |
| 3.4 构建敲除弓形虫GRA16的CRISPR-CAS9体系 |
| 3.5 制备弓形虫GRA16小鼠多克隆抗体 |
| 3.6 GRA16敲除验证 |
| 3.7 GRA16减弱宿主细胞γH2AX表达 |
| 3.8 喜树碱诱导的DNA损伤彗星实验 |
| 4. 讨论 |
| 5. 本章小结 |
| 第六章 磷酸酶PPM1D参与GRA16加速γH2AX去磷酸化的过程 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞株 |
| 2.1.2 质粒载体 |
| 2.1.3 实验试剂和耗材 |
| 2.1.4 实验设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 构建GRA16-237aa截短表达真核载体 |
| 2.2.2 质粒转染 |
| 2.2.3 免疫印迹 |
| 2.2.4 免疫荧光 |
| 2.2.5 抽提细胞RNA |
| 2.2.6 逆转录cDNA |
| 2.2.7 荧光定量PCR |
| 2.2.8 HeLa细胞基因编辑 |
| 3. 结果 |
| 3.1 弓形虫GRA16减弱γH2AX的表达依赖于γH2AX的加速去磷酸化 |
| 3.2 弓形虫GRA16减弱细胞γH2AX表达与其结合磷酸酶PP2A能力不相关 |
| 3.3 过表达GRA16的细胞在DNA损伤修复过程中上调磷酸酶PPM1D表达 |
| 3.4 构建PPM1D缺失HeLa细胞株 |
| 3.5 PPM1D参与GRA16加速γH2AX去磷酸化的过程 |
| 4. 讨论 |
| 5. 本章小结 |
| 全文总结 |
| 研究展望 |
| 创新点 |
| 附录1 |
| 表1 引物序列信息 |
| 附录2 弓形虫SAG1重组抗体制备及抗原表位鉴定 |
| 1. 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 虫株、细胞株、感受态细胞及质粒 |
| 2.2 RNA提取、逆转录实验、凝胶回收和质粒提取 |
| 2.3 SAG1重组蛋白表达纯化及小鼠免疫 |
| 2.4 杂交瘤融合和筛选 |
| 2.5 克隆杂交瘤的重链和轻链 |
| 2.6 重组抗体表达和验证 |
| 2.7 重组抗体抗原表位鉴定 |
| 3. 结果 |
| 3.1 SAG1 (45-198 aa)基因片段克隆 |
| 3.2 SAG1 (45-198 aa)重组蛋白诱导表达 |
| 3.3 SAG1杂交瘤构建 |
| 3.4 SAG1重组抗体表达质粒构建 |
| 3.5 SAG1重组抗体验证 |
| 3.6 重组抗体抗原表位鉴定 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 科研成果 |
| 致谢 |
（10）冰岛硫化叶菌CRISPR激活蛋白Csa3a对DNA损伤修复调控的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 前言 |
| 1.1 CRISPR-Cas系统概述 |
| 1.1.1 CRISPR-Cas系统的分类 |
| 1.1.2 CRISPR-Cas系统的功能 |
| 1.1.3 CRISPR-Cas系统的作用机制 |
| 1.1.3.1 spacer的获取 |
| 1.1.3.2 crRNA的转录加工 |
| 1.1.3.3 干涉 |
| 1.1.4 CRISPR-Cas系统的调控 |
| 1.2 古菌概述 |
| 1.3 硫化叶菌概述 |
| 1.4 DNA损伤应答 |
| 1.4.1 真核生物的DNA损伤应答 |
| 1.4.2 细菌的DNA损伤应答 |
| 1.4.3 泉古菌DNA损伤应答 |
| 1.5 Csa3a蛋白 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 菌株和质粒 |
| 2.2 培养基配方及培养条件 |
| 2.3 主要分子生物学试剂 |
| 2.4 主要实验仪器 |
| 2.5 实验方法 |
| 2.5.1 大肠杆菌DH5α感受态制备和热激转化法 |
| 2.5.2 硫化叶菌感受态的制备和电击转化法 |
| 2.5.3 含lac S报告基因质粒的构建及β-galactosidase(Lac S)酶活分析 |
| 2.5.4 Csa3a蛋白的表达和纯化 |
| 2.5.5 凝胶阻滞分析(EMSA) |
| 2.5.6 表面等离子共振技术(SPR) |
| 2.5.7 细胞聚集分析 |
| 2.5.8 流式细胞术分析 |
| 2.5.9 活细胞计数分析 |
| 2.5.10 生长曲线测定 |
| 2.5.11 平板滴定实验分析 |
| 2.5.12 RNA抽提及RT-q PCR |
| 2.5.13 转录组测序及分析 |
| 2.5.14 DNase I足迹实验 |
| 2.5.15 检测CRISPR适应 |
| 2.5.16 Ups和 Ced系统介导的DNA修复实验 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 Csa3a蛋白是DDR基因的转录激活因子 |
| 3.2 Csa3a蛋白结合DDR基因启动子的体内实验 |
| 3.2.1 lacS报告基因质粒的构建 |
| 3.2.2 报告基因质粒在不同宿主菌中LacS酶活的检测 |
| 3.3 Csa3a蛋白结合DDR基因启动子的体外实验 |
| 3.3.1 Csa3a蛋白与ups基因启动子的结合 |
| 3.3.2 Csa3a蛋白与ced启动子的结合 |
| 3.3.3 Csa3a蛋白与cdc6-2 启动子的结合 |
| 3.3.4 Csa3a蛋白与tfb3 启动子的结合 |
| 3.4 DNA损伤剂对csa3a缺失株生长及活力的影响 |
| 3.4.1 DNA损伤剂处理后csa3a缺失株的生长曲线 |
| 3.4.2 DNA损伤剂处理后csa3a缺失株的平板滴定实验 |
| 3.4.3 DNA损伤剂处理后对csa3a缺失株活细胞数的影响 |
| 3.5 DNA损伤剂对csa3a缺失株细胞周期及表型的影响 |
| 3.5.1 DNA损伤剂对csa3a缺失株细胞周期的影响 |
| 3.5.2 DNA损伤剂对csa3a缺失株细胞生长表型的影响 |
| 3.6 csa3a 缺失株对 Ups 和 Ced 系统介导的 CRISPR 干涉导致的DNA 损伤修复的影响 |
| 3.7 csa3a缺失株对病毒入侵的影响 |
| 3.8 DNA损伤对菌株CRISPR原发适应的影响 |
| 3.9 Csa3a蛋白与自身启动子的结合 |
| 3.9.1 Csa3a蛋白与csa3a启动子的EMSA实验 |
| 3.9.2 Csa3a蛋白与csa3a启动子的DNase I footprinting实验 |
| 4 讨论与展望 |
| 4.1 Csa3a蛋白对DNA修复基因的转录激活作用 |
| 4.2 Csa3a蛋白调控Ced修复系统的机制及意义 |
| 4.3 Ced系统修复CRISPR-Cas系统自身免疫的意义 |
| 4.4 调控Csa3a蛋白机制研究的意义 |
| 4.5 Csa3a介导的CRISPR-Cas系统与DNA损伤修复模型 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 研究生期间学术成果 |
| 致谢 |
四、DNA损伤与修复（论文参考文献）
- [1]DNA损伤与修复在食管癌中的研究进展[J]. 许海军,阮豪杰,陈攀,李孟祥,高社干. 食管疾病, 2021(03)
- [2]电离辐射诱导非小细胞肺癌DNA损伤与线粒体功能紊乱的应答机理研究[D]. 严俊芳. 中国科学院大学(中国科学院近代物理研究所), 2021(01)
- [3]稻瘟病菌MoRAD26和MoMEC1在DNA损伤修复及致病过程中的功能分析[D]. 王聪聪. 中国农业科学院, 2021
- [4]基于DNA分子水平预测放射生物效应的机制模型的研究及应用[D]. 齐雅平. 中国科学技术大学, 2021(09)
- [5]DNA-PK-AKT信号通路通过增强微管动态变化促进DNA损伤修复[D]. 马淑云. 武汉大学, 2021(02)
- [6]circRNA057504在苯并[a]芘致人支气管上皮细胞DNA损伤中的功能及机制研究[D]. 丘妙韵. 广州医科大学, 2021
- [7]CircRNA005962在炭黑纳米颗粒致呼吸道上皮细胞DNA损伤中的功能及机制研究[D]. 张晗. 广州医科大学, 2021
- [8]苯肾上腺素上调ARP3减轻颌下腺DNA辐射损伤[D]. 张冲. 大连医科大学, 2021(01)
- [9]弓形虫致密颗粒蛋白GRA16抑制宿主细胞DNA损伤修复机制研究[D]. 庄浩瀚. 浙江大学, 2021
- [10]冰岛硫化叶菌CRISPR激活蛋白Csa3a对DNA损伤修复调控的研究[D]. 刘真真. 华中农业大学, 2020(04)