拟南芥G3Pps磷转运功能研究

论文摘要

磷作为植物生长发育和新陈代谢的重要矿物质元素,在植物的整个生命过程中扮演着重要的作用。无机磷作为能被植物吸收利用的有效磷,土壤中低的浓度已成为制约农业生产的重要因素。了解植物无机磷吸收、转运和累积的机制,从而提高植物磷素利用效率,在生产应用上极具指导意义。拟南芥中甘油-3-磷酸通透酶（Glycerol-3-phosphate permease,G3Pp）在磷饥饿诱导时表达升高,提示其在植物Pi转运平衡过程中具有一定的作用。G3Pps有5个同源基因,本实验通过拟南芥G3Pp1/2/3的定位和功能分析,初步证实G3Pp为拟南芥液泡膜上的液泡磷转运体,具有Pi转运能力。生物信息学分析发现G3Pp1、G3Pp2和G3Pp3在氨基酸序列和蛋白结构上具有较高的相似性。预测G3Pp1有12个跨膜结构域,G3Pp2和G3Pp3各有11个跨膜结构域,与SPX（酵母的SYG1,PHO81和人类/XPR1的共有同源序列）-MFS（Major Facility Superfamily）亚家族磷转运蛋白具有相似的结构;通过与水稻中液泡膜磷转运体蛋白OsVPE1/2亲缘关系分析,推测拟南芥G3Pp1、G3Pp2和G3Pp3蛋白也可能定位于液泡膜上。激光共聚焦显微镜观察拟南芥表达G3Pps-GFP融合蛋白的叶肉细胞中绿色荧光与液泡膜基本重合。进一步利用烟草瞬时转化技术,分离烟草叶肉细胞原生质体,清晰观察G3Pp1、G3Pp2和G3Pp3定位于液泡膜上。构建pG3Pps genmome fragmen:GUS载体,花序浸染法转化拟南芥,转基因植株的组织化学染色清楚地显示,G3Pp1基因在植物根、茎、叶内和生长的不同时期均有表达;G3Pp2和G3Pp3基因的表达模式基本相同,只在幼苗期的根部和子叶内表达。2.5μM低磷胁迫时,转入G3Pp1和G3Pp3基因植株根部GUS染色明显加深,表达量增加,G3Pp2的表达没有显著影响。与之对应的,实时定量PCR分析基因表达也显示基本相同的结果,低磷胁迫时G3Pp1/2/3表达量均有上升,根部上升程度大于地上部分,G3Pp3表达量上升显著。这些结果说明三个基因表达水平都受到低磷浓度变化的影响。G3Pp1/2/3基因的T-DNA突变体在低磷处理后磷含量较野生型有增加,而根的相对生长量低于野生型,可能由于突变体难以通过储存的液泡磷外排缓解低磷的胁迫,而使生长受到抑制。因此,G3Pp1/2/3可能参与着液泡内磷的外排,其功能与水稻中OsVPE1/2相同。CBL（Calcineurin B-like protein）-CIPK（CBL-interacting protein kinase）信号通路在植物的生长发育、新陈代谢和响应胁迫方面发挥着无可替代的作用。CBL-CIPK信号通路可调节植物细胞内Na+、K+、Mg2+和H+等无机营养元素的平衡稳态。我们借助于酵母双杂交和双分子荧光互补的方法,探究G3Pps与CIPK之间的相互作用。结果发现,G3Pp1、G3Pp2和G3Pp3可以和CIPK家族的蛋白CIPK11、21和26发生相互作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
•   1.1 磷元素在植物中的特性
•     1.1.1 植物中磷元素的功能
•     1.1.2 低磷对植物的影响
•   1.2 不同部位的磷转运体
•     1.2.1 质膜磷转运体
•     1.2.2 质体磷转运体
•     1.2.3 线粒体转运体
•     1.2.4 高尔基体磷转运体
•     1.2.5 液泡磷转运体
•   1.3 G3PP基因家族的研究进展
•   1.4 CIPK研究进展
•   1.5 研究的目的和意义
• 第二章 G3PP1/2/3 基因生物信息学分析和亚细胞定位
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 植物材料
•     2.1.2 菌株和质粒
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 G3Pp1/2/3 基因及蛋白软件分析
•     2.2.2 植物的种植及培养
•     2.2.3 GFP载体构建
•     2.2.4 质粒的提取
•     2.2.5 农杆菌感受态细胞的制备及转化
•     2.2.6 拟南芥的遗传转化
•     2.2.7 植物总DNA的提取
•     2.2.8 烟草瞬时转化
•     2.2.9 烟草原生质体的制备及观察
•   2.3 结果与分析
•     2.3.1 G3Pp1、G3Pp2和G3Pp3基因结构及编码的氨基酸分析
•     2.3.2 G3Pp1/2/3蛋白跨膜结构域分析
•     2.3.3 GFP载体的构建结果分析
•     2.3.4 G3Pp1/2/3亚细胞定位结果
•   2.4 小结和讨论
• 第三章 G3PP1/2/3 基因表达和生理分析
•   3.1 实验材料及试剂
•     3.1.1 植物材料
•     3.1.2 菌株和质粒
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 G3Pp1、G3Pp2和G3Pp3 在不同组织中的表达预测
•     3.2.2 GUS活性的组织化学观察
•     3.2.3 纯合突变体验证
•     3.2.4 植物总RNA的提取
•     3.2.5 RNA反转录
•     3.2.6 实时定量PCR
•     3.2.7 G3Pp1/2/3 突变体植株表型观察
•     3.2.8 磷含量测定
•   3.3 结果与分析
•     3.3.1 G3Pp1、G3Pp2和G3Pp3在不同组织中的表达模式
•     3.3.2 G3Pp1/2/3-GUS转基因拟南芥遗传转化结果
•     3.3.3 G3Pp1/2/3-GUS转基因植株表达模式
•     3.3.4 磷胁迫下G3Pp1/2/3基因的表达量结果分析
•     3.3.5 突变体植株的验证
•     3.3.6 磷胁迫下G3Pp1/2/3突变体植株表型观察和根长测定结果
•     3.3.7 不同突变体内磷含量的测定结果
•   3.4 小结与讨论
• 第四章 G3PP1/2/3与CIPK基因的相互作用关系
•   4.1 实验材料及试剂
•     4.1.1 植物材料
•     4.1.2 菌株和质粒
•   4.2 实验方法
•     4.2.1 载体的构建
•     4.2.2酵母双杂交实验
•   4.3 实验结果及讨论
•     4.3.1 酵母双杂交实验
•     4.3.2 双分子荧光互补实验
•   4.4 小结与讨论
• 第五章 结论与展望
•   5.1 结论
•   5.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间取得的科研成果
• 附录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王朝臣

导师: 步怀宇

关键词: 拟南芥,甘油磷酸通透酶,液泡磷转运体

来源: 西北大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 西北大学

分类号: Q943.2

总页数: 72

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