柯萨奇病毒B组3型结构蛋白VP2对心肌细胞损伤的机制初探

论文摘要

目的:初步探究柯萨奇病毒B组3型（Coxsackies virus,CVB3）的结构蛋白VP2对心肌细胞的影响,为研究CVB3引起病毒性心肌炎的致病机制提供理论基础。方法:1.以CVB3病毒RNA为模板,逆转录为cDNA,PCR扩增VP2基因,同时构建蛋白融合表达质粒pCAG-2Strep-Flag-VP2,pCAG-2Strep-Flag-VP2-APEX2和腺病毒载体pAdTrack-2Strep-Flag-VP2,pAdTrack-2Strep-Flag-VP2-APEX2,并包装成重组腺病毒颗粒Ad-VP2和Ad-VP2-APEX2,扩增后测定重组腺病毒颗粒的滴度;2.原代心肌细胞的提取:取新生SD大鼠（1-3天）心肌组织,研磨至1-3mm3的组织块,用0.1%的胰酶消化8-10次,每次10分钟,离心收集细胞,差速贴壁2h后获得搏动的心肌细胞;3.以Ad-VP2（MOI=10）感染心肌细胞后观察光学显微镜下细胞形态变化;4.通过CCK8方法检测Ad-VP2（MOI=10）感染心肌细胞后0 h,24 h,48h,72 h的细胞增殖变化;5.Ad-VP2-APEX2（MOI=10）感染NRVCs,利用APEX2技术筛选与之相互作用的宿主蛋白,并利用免疫荧光和免疫共沉淀法再次验证VP2蛋白与宿主蛋白的相互作用;6.利用Annexin V/FITC标记流式细胞术检测Ad-VP2重组腺病毒对心肌细胞凋亡的影响;7.通过DCFH-DA探针标记检测细胞内活性氧（Reactive oxygen,ROS）水平;8.利用Western blot检测Ad-VP2重组腺病毒感染NRVCs后S100A6,β-Catenin和c-Myc的蛋白表达量。结果:1.成功获得表达CVB3 VP2蛋白的重组腺病毒Ad-VP2和Ad-VP2-APEX2;2.Ad-VP2感染心肌细胞72 h后,细胞增殖能力降低;感染第5天后开始出现细胞病变效应,感染第14天后细胞死亡;3.通过APEX技术筛选到41个可能与VP2相互作用的宿主蛋白,进一步利用免疫荧光和免疫共沉淀证明宿主蛋白S100A6与VP2蛋白具有相互作用;4.Ad-VP2感染心肌细胞24 h、48 h,72 h后,随着感染时间的延长,细胞凋亡率增加;5.Ad-VP2感染细胞0 h、24 h、48 h和72 h后,检测到细胞内ROS水平升高,其中感染48 h后ROS水平达到峰值;6.Ad-VP2感染细胞后,细胞内S100A6、β-Catenin和c-Myc蛋白表达量增加。结论:CVB3病毒VP2蛋白可能通过以下两种途径引起细胞病变效应,导致心肌细胞死亡:（1）诱导细胞凋亡;（2）VP2与钙连接蛋白S100A6相互作用激活了β-Catenin/c-Myc通路,引起细胞内氧化应激,从而导致心肌细胞损伤。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 中英文缩略词表
• 第1章 引言
•   1.1 概述
•   1.2 VP2 蛋白
•   1.3 病毒载体技术
•   1.4 蛋白相互作用的筛选
•   1.5 S100A6 蛋白
•   1.6 本论文研究基础和研究意义
• 第2章 材料与方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 菌株
•     2.1.2 质粒
•     2.1.3 主要试剂
•     2.1.4 主要仪器和设备
•     2.1.5 培养基和缓冲液的配制
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 pCAG-2Strep-Flag-VP2-APEX2 重组质粒的构建
•       2.2.1.1 引物设计与合成
•       2.2.1.2 RT-PCR扩增VP2 基因
•       2.2.1.3 pCAG-2Strep-Flag-APEX2 质粒双酶切
•       2.2.1.4 VP2 与质粒pCAG-2Strep-Flag-APEX2 的连接反应
•       2.2.1.5 大肠杆菌DH5α的转化
•       2.2.1.6 菌落PCR初步鉴定重组质粒
•       2.2.1.7 测序验证
•     2.2.2 腺病毒的制备
•       2.2.2.1 引物设计
•       2.2.2.2 PCR扩增目的基因
•       2.2.2.3 pAdTrack-CMV质粒双酶切
•       2.2.2.4 2Strep-Flag-VP2-APEX2 与质粒pAdTrack-CMV连接
•       2.2.2.5 大肠杆菌DH5α的转化
•       2.2.2.6 菌落PCR初步鉴定重组质粒
•       2.2.2.7 测序验证
•       2.2.2.8 重组质粒的纯化提取
•       2.2.2.9 PmeI酶线性化pAdtrack-CMV-2Strep-Flag-VP2-APEX2 质粒
•       2.2.2.10 回收Pme I酶切后线性化质粒
•       2.2.2.11 酶切后线性化质粒和pAdeasy-1 共转化成重组腺病毒质粒
•       2.2.2.12 腺病毒重组质粒鉴定
•       2.2.2.13 将获得的重组质粒转化到XL10-Gold感受态细胞中
•       2.2.2.14 采用PEG8000 法质粒大抽腺病毒重组质粒
•       2.2.2.15 腺病毒的包装、扩增和浓缩
•       2.2.2.16 Real-Time PCR测腺病毒滴度
•     2.2.3 提取原代心肌细胞
•     2.2.4 细胞培养
•       2.2.4.1 细胞复苏
•       2.2.4.2 细胞传代
•       2.2.4.3 细胞冻存
•     2.2.5 质粒转染
•     2.2.6 细胞蛋白的提取
•     2.2.7 质谱分析前样本准备
•       2.2.7.1 质谱样本的准备
•       2.2.7.2 Western blot检测目的基因的表达
•       2.2.7.3 SDS-PAGE获取质谱样本
•     2.2.8 挑取质谱结果中可能与VP2 具有相互作用的基因构建质粒
•     2.2.9 细胞内免疫共沉淀
•     2.2.10 细胞内免疫荧光
•     2.2.11 腺病毒感染心肌细胞
•     2.2.12 CCK-8 细胞活性检测
•     2.2.13 Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测
•     2.2.14 活性氧检测
•     2.2.15 统计学分析
• 第3章 结果
•   3.1 重组腺病毒Ad-VP2-APEX2和Ad-VP2 的构建与表达
•     3.1.1 重组腺病毒载体的构建
•     3.1.2 重组腺病毒的包装与扩增
•     3.1.3 重组腺病毒滴度的测定
•   3.2 VP2对NRVCs的损伤作用
•     3.2.1 NRVCs的提取
•     3.2.2 VP2 感染心肌细胞后的形态变化
•     3.2.3 VP2 抑制H9C2 细胞的增殖
•   3.3 筛选与CVB3 VP2 相互作用的蛋白
•     3.3.1 APEX筛选与VP2 具有相互作用的蛋白
•     3.3.2 S100A6与VP2 可能具有直接相互作用
•       3.3.2.1 构建重组质粒pCDNA3.1（-）-3HA-S100A
•       3.3.2.2 细胞内免疫共沉淀检测S100A6与VP2 的相互作用
•       3.3.2.3 共聚焦显微镜成像分析系统观察S100A6与VP2 存在细胞共定位
•   3.4 VP2 诱导细胞凋亡
•   3.5 S100A6与VP2 的相互作用介导β-Catenin/c-Myc通路
•     3.5.1 VP2 激活β-Catenin/c-Myc表达
•     3.5.2 VP2 促进细胞内ROS生成
• 第4章 讨论
•   4.1 构建VP2 重组腺病毒
•   4.2 VP2 蛋白对细胞活性的影响
•   4.3 APEX技术筛选相互作用蛋白
•   4.4 VP2 对心肌细胞损伤机制的初探
•     4.4.1 S100A6、β-Catenin/c-Myc与心脏疾病
•     4.4.2 细胞凋亡
•     4.4.3 氧化应激损伤
• 第5章 结论与展望
•   5.1 结论
•   5.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 攻读学位期间的研究成果
• 综述
• 附录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王珂

导师: 黄孝天

关键词: 柯萨奇病毒,腺病毒载体,细胞凋亡

来源: 南昌大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 南昌大学

基金: 国家自然科学基金(No.31660035),江西省自然科学基金重点项目(2017ACB200003),南昌大学研究生创新专项资金项目(CX2017255)

分类号: R373

总页数: 82

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