基于南海海洋沉积物宏基因组学的新型抗菌肽挖掘与表达

论文摘要

抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)是一类具有抗病毒、抗真菌、抗细菌及抑制癌细胞生长等生物学功能的小肽,是一类重要的抗生素潜在替代品,其在生物医药、食品防腐及畜牧业绿色养殖等领域有着广泛应用。本课题以南海海洋沉积物为研究出发材料,构建了宏基因组文库;利用基于抗菌肽功能的筛选方法挖掘了具有产业应用价值的新型抗菌肽;之后应用氨基酸测序技术测析了其一级结构;随后利用基因工程技术和枯草芽孢杆菌表达系统优化出了新型抗菌肽的胞外表达体系。本文的主要结论是:1.应用宏基因组技术从南海海洋沉淀物中提取、纯化并获得了的宏基因组文库DNA。2.在南海海洋沉积物宏基因组文库DNA基础上,构建出了基于枯草芽孢杆菌表达系统的宏基因组文库。3.应用抗菌肽功能平板筛选从南海海洋沉淀物宏基因组文库中筛选出了产生抑菌圈的阳性克隆子,之后应用DNA测序技术获取新抗菌肽的碱基序列。4.对筛选得到抗菌肽进行了温度、酸碱度和酶的耐受性以及抑菌谱、抑菌效价等方面的生物学特性研究,获得了一个特殊生物学特性的抗菌肽,命名为Naseain 9。5.应用自动Edman降解测序技术测定出了 Naseain 9的氨基酸序列为VLTKKKPINTIYCGTVPCQGKKKRMGGLVKK,并应用生物信息学的方法预测了Naseain 9二级结构。6.基于新型抗菌肽Naseain 9结构,结合生物信息学和偏爱密码子方法,优化出适宜于在枯草芽孢杆菌宿主菌中表达的新型抗菌肽DNA序列GTTCTKACAAAAAAAAAACCGATTAATACAATTTATTGCGGCACAG TTCCGTGCCAAGGCAAAAAAAAAAGAATGGGCGGCCTKGTTAAA AAA。7.构建出了基于枯草芽孢杆菌表达系统组件最优组合的新型抗菌肽高效分泌表达体系BNAS,其在摇瓶水平下1 L发酵液上清中最高可获得89 mg的Naseain 9样品。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 上篇 文献综述
•   第一章 抗菌肽的研究现状与进展
•     1.1 抗菌肽的发现
•     1.2 抗菌肽的来源及种类
•       1.2.1 具有螺旋结构的线性抗菌肽
•       1.2.2 富含特定氨基酸的线性抗菌肽
•       1.2.3 具有一个二硫键的抗菌肽
•       1.2.4 具有两个或多个二硫键的抗菌肽
•       1.2.5 含羊毛硫及其它结构的抗菌肽
•     1.3 抗菌肽的作用特点
•     1.4 抗菌肽的作用机制
•     1.5 抗菌肽在不同领域的应用前景及其存在的问题
•       1.5.1 抗菌肽在生物医药领域的应用
•       1.5.2 抗菌肽在食品防腐领域的应用
•       1.5.3 抗菌肽在农业病害防控领域的应用
•       1.5.4 抗菌肽在应用中所存在的问题
•     1.6 海洋抗菌肽资源的优势
•     1.7 海洋抗菌物质资源挖掘的研究进展
•   第二章 枯草芽孢杆菌表达系统
•     2.1 枯草芽孢杆菌表达系统的特点及研究进展
•     2.2 基因在枯草芽孢杆菌中表达所需的组件
•       2.2.1 多δ因子
•       2.2.2 启动子
•       2.2.3 终止子
•     2.3 蛋白质在枯草芽孢杆菌中的分泌
•     2.4 枯草芽孢杆菌提高基因表达量的影响因素
•       2.4.1 密码子的选取
•       2.4.2 目的基因的拷贝数
•       2.4.3 载体的选用
•       2.4.4 枯草芽孢杆菌的培养条件
•       2.4.5 启动子的强弱
•       2.4.6 翻译起始的效率
•     2.5 枯草芽孢杆菌表达体系中所存在的问题及发展方向
•     2.6 枯草芽孢杆菌表达系统的优势
•     2.7 本研究的目的和意义
•     2.8 本研究的技术路线
• 下篇 试验研究
•   第三章 深海沉积物宏基因组文库构建
•     3.1 引言
•     3.2 材料与方法
•       3.2.1 材料与样品
•       3.2.2 沉积物基因组总DNA的提取
•       3.2.3 沉积物基因组总DNA的纯化
•       3.2.4 基于枯草芽孢杆菌的宏基因组文库的构建
•       3.2.5 重组克隆子的鉴定
•       3.2.6 克隆子保存
•     3.3 结果
•       3.3.1 沉积物基因组总DNA的提取
•       3.3.2 文库质量鉴定及评价
•       3.3.3 抗菌肽克隆筛选
•     3.4 讨论
•     3.5 小结
•   第四章 所获抗菌肽结构分析及生物学特性研究
•     4.1 引言
•     4.2 材料和方法
•       4.2.1 抗菌肽抑菌活性分析
•       4.2.2 抗菌肽对HT-29细胞的裂解活性
•       4.2.3 抗菌肽稳定性测定
•       4.2.4 抗菌肽一级和二级结构分析
•       4.2.5 数据统计分析
•     4.3 结果
•       4.3.1 抗菌肽对多种细菌的抑菌活性和细胞毒性
•       4.3.2 抗菌肽在不同条件下的稳定性测定
•       4.3.3 抗菌肽结构分析
•     4.4 讨论
•     4.5 小结
•   第五章 新型抗菌肽Naseain 9的高效表达
•     5.1 引言
•     5.2 材料和方法
•       5.2.1 重组枯草芽孢杆菌BNAS菌株的构建
•       5.2.2 重组枯草芽孢杆菌BNAS的摇瓶发酵
•       5.2.3 总RNA的分离和实时定量PCR
•     5.3 结果
•       5.3.1 重组枯草芽孢杆菌BNAS菌株的构建
•       5.3.2 重组枯草芽孢杆菌BNAS菌株的摇瓶水平发酵
•       5.3.3 抗菌肽Naseain 9的表达合成
•     5.4 讨论
•     5.5 小结
• 参考文献
• 附录一 质粒转化枯草芽孢杆菌WB600感受态细胞的方法
• 附录二 比浊法测定抗菌肽抑菌率方法
• 附录三 质粒转化大肠杆菌DH5α方法
• 致谢
• 博士生期间发表的学术论文,专著
• 博士后期间发表的学术论文,专著
• 个人简历
• 永久通信地址

文章来源

类型: 博士论文

作者: 姬生跃

导师: 张宏福

关键词: 宏基因组文库,海洋沉淀物,抗菌肽,枯草芽孢杆菌表达系统,重组表达

来源: 中国农业科学院

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 中国农业科学院

基金: 国家自然科学基金面上项目(31772641),中国博上后科学基金项目(2017M611071),中国博士后科学基金特别资助项目(2018T110168)

分类号: Q78

DOI: 10.27630/d.cnki.gznky.2019.000008

总页数: 77

文件大小: 6531K

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