表达IBDV VP2蛋白的重组弱毒肠炎沙门菌的构建及其免疫原性的初步研究

论文摘要

为研究肠炎沙门菌rfaH基因与致病性的关系及肠炎沙门菌rfaH基因缺失株作为疫苗载体的可行性,进一步探索传染性法氏囊病（IBD）的防控路径,通过λ-Red同源重组的方法构建了缺失rfaH基因的肠炎沙门菌（rSD）,再以其为亲本菌株构建了稳定表达IBDV VP2蛋白的重组肠炎沙门菌（Se-VP2）。以1日龄SPF雏鸡为实验动物,分别检测了重组菌的致病力及免疫效果。结果显示,rSD株和Se-VP2株与野生株生长速度一致,体外连续传20代,基因缺失株和重组株均可稳定遗传;Western-blot表明,Se-VP2株可稳定表达VP2蛋白;构建的重组菌rSD株和Se-VP2株对SPF雏鸡无致病性,半数致死量（LD50）大于1.0×1010CFU,且重组菌Se-VP2株免疫动物后可同时诱导产生针对IBDV和沙门菌的抗体;重组菌Se-VP2株可以诱导T淋巴细胞产生Th1型细胞因子IFN-γ和Th2型细胞因子IL-4,并能刺激外周血淋巴细胞的增殖分化;攻毒保护性试验结果显示,Se-VP2株免疫动物后可对IBDV和沙门菌的感染提供100%的保护。结果表明,rfaH基因是沙门菌的毒力基因,重组弱毒肠炎沙门菌Se-VP2株作为疫苗候选株,对SPF雏鸡安全有效,为后续肠炎沙门菌作为表达载体的研究奠定了基础。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1 主要试验材料
•   1.2 引物
•   1.3 沙门菌分离鉴定
•     1.3.1 沙门菌的分离培养
•     1.3.2 革兰染色
•     1.3.3 16S rRNA序列分析
•     1.3.4 血清型鉴定
•   1.4 IBDV LN株的VP2基因序列分析
•   1.5 rfaH基因缺失株的构建
•     1.5.1 打靶片段的制备
•     1.5.2 rfaH基因的敲除
•     1.5.3 抗性基因的消除
•   1.6 重组VP 2基因的沙门菌的构建
•     1.6.1 打靶载体的构建
•     1.6.2 打靶片段的制备
•     1.6.3 重组VP 2基因的肠炎沙门菌的构建
•     1.6.4 抗性基因的消除
•   1.7 rfaH基因突变菌 （r SD） 及重组菌 （Se-VP2） 的PCR鉴定
•   1.8 重组菌体外传代稳定性
•   1.9 SD株、rSD株及Se-VP2株生长曲线的测定
•   1.1 0 重组蛋白在沙门菌中的表达及鉴定
•   1.1 1 动物试验
•     1.1 1.1 野生菌SD株、基因缺失菌rSD株及重组菌Se-VP2株的动物致病性试验
•     1.11.2基因缺失菌rSD株、重组菌Se-VP2株及VP2蛋白油苗的雏鸡免疫试验
•     1.1 1. 3 鸡IL-4和IFN-γ含量及淋巴细胞增殖活性检测
•     1.1 1. 4 免疫攻毒保护试验
•   1.1 2 数据统计分析
• 2 结果
•   2.1 沙门菌的分离鉴定
•     2.1.1 分离培养及革兰染色鉴定
•     2.1.216S rRNA序列分析
•     2.1.3 血清型鉴定
•   2.2 IBDV VP2基因的遗传进化分析
•   2.3 rfa H基因缺失株的鉴定
•   2.4 重组VP2基因的肠炎沙门菌的鉴定
•   2.5 重组菌体外稳定性试验
•   2.6 SD株、rSD株及Se-VP2株生长曲线的测定
•   2.7 重组蛋白在沙门菌中的表达及鉴定
•   2.8 动物试验
•     2.8.1 细菌致病性试验
•     2.8.2 雏鸡免疫试验
•     2.8.3 鸡IL-4和IFN-γ含量及淋巴细胞增殖活性检测
•     2.8.4 免疫攻毒保护性试验
• 3 讨论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 孙化露,李树纯,于泽坤,李明义,李思菲,崔现兰,刘阳

关键词: 重组,肠炎沙门菌,传染性法氏囊病毒,表达载体

来源: 中国兽医科学 2019年04期

年度: 2019

分类: 农业科技,基础科学

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 山东信得科技股份有限公司,扬州大学兽医学院

基金: 青岛市科技创新领军人才项目(16-8-3-14-zhc)

分类号: S852.61

DOI: 10.16656/j.issn.1673-4696.2019.0068

页码: 440-452

总页数: 13

文件大小: 2384K

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