构架蛋白AXIN1通过促进GCL全酶的形成来应对APAP造成的氧化压力

论文摘要

作为一种多功能构架蛋白,AXIN1可以与许多种类的蛋白发生相互作用。据报道,AXIN1参与并调节许多信号通路,从而实现对胚胎发育、细胞命运以及能量代谢等方面的调控。我们之前发现,Axinl肝脏特异性敲除的小鼠在过量的对乙酰氨基酚(APAP)刺激之后,肝损伤情况更严重,谷胱甘肽(GSH)合成限速酶谷氨酰半胱氨酸连接酶(GCL)的酶活性更低,同时伴随着GSH水平更大幅度地下降。因此,我们认为AXIN1很有可能通过促进GSH的合成以应对APAP诱发的急性肝损伤,从而起到保护肝脏的作用。但导致这个表型的分子机制尚未报道。在本论文中,我们发现,在APAP刺激下,敲除Axin1的原代肝细胞中GSH水平更大幅度地下降,同时GCL酶活更低,因此确定是肝细胞中的AXIN1在这个过程中起到重要作用。研究证明,比起催化亚基(GCLC)单体,与调节亚基(GCLM)结合形成的GCL复合体的催化活性得到显著提高。在HEK293T细胞中,我们发现AXIN1与GCL的两个亚基有直接的相互作用,并且它们的相互作用在慢病毒介导的AXIN1敲低的细胞中减弱。深入研究发现,APAP不仅可以增强肝脏组织中GCL两个亚基间的相互作用,还可以诱导AXIN1与GCL两个亚基的相互作用。我们在腺相关病毒介导的肝脏GCL过表达的小鼠中也进一步验证了AXIN1在APAP诱导GCL复合体的形成过程中的重要作用。这些结果表明,AXIN1作为构架蛋白或许有助于GCL形成全酶来应对APAP刺激所引起的GSH的耗竭。这个发现揭示了多功能蛋白AXIN1在氧化应激下的新功能,有可能为APAP中毒相关的临床研究提供潜在的治疗靶点。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
•   1.1 构架蛋白AXIN1
•     1.1.1 AXIN1的简介
•     1.1.2 AXIN1的修饰与调控
•     1.1.3 AXIN1的生物学功能
•   1.2 谷胱甘肽（GSH）
•     1.2.1 GSH的简介
•     1.2.2 GSH合成的途径
•     1.2.3 GSH合成的调控
•     1.2.4 GSH合成的生理意义
•   1.3 谷氨酰半胱氨酸连接酶（GCL）
•     1.3.1 GCL的简介
•     1.3.2 GCLC的调控
•     1.3.3 GCLM的调控
•   1.4 对乙酰氨基酚（APAP）
•     1.4.1 APAP的简介
•     1.4.2 APAP的代谢调控
•     1.4.3 APAP诱导肝损伤的机理
•   1.5 立题背景
• 第二章 材料和方法
•   2.1 抗体和试剂
•   2.2 DNA相关实验
•     2.2.1 蛋白表达质粒的构建
•     2.2.2 RNA干扰质粒的构建
•     2.2.3 腺相关病毒质粒的构建
•   2.3 细胞相关实验
•     2.3.1 细胞培养
•     2.3.2 瞬时转染与免疫共沉淀
•     2.3.3 慢病毒的包装与感染
•     2.3.4 腺相关病毒的包装与纯化
•   2.4 动物相关实验
•     2.4.1 动物品系与背景
•     2.4.2 APAP诱导小鼠肝损伤模型的建立
•     2.4.3 腺相关病毒介导肝脏GCL过表达的小鼠模型的建立
•     2.4.4 小鼠原代肝细胞的分离与培养
•   2.5 小鼠肝脏相关指标测定
•     2.5.1 总谷胱甘肽的测定
•     2.5.2 丙二醛的测定
•     2.5.3 γ-谷氨酰半胱氨酸连接酶（GCL）酶活测定
•     2.5.4 肝脏蛋白总裂解液的提取
•     2.5.5 Bradford法测定蛋白质浓度
•     2.5.6 Western blot分析
•   2.6 统计学分析
• 第三章 结果和讨论
•   3.1 结果
•     3.1.1 肝脏特异性敲除Axin1的小鼠肝脏对于APAP诱导的GSH的耗竭更敏感
•     3.1.2 肝脏特异性敲除Axin1的小鼠原代肝细胞对于APAP诱导的GSH的耗竭更加敏感
•     3.1.3 AXIN1与GCL的两个亚基有直接相互作用
•     3.1.4 GCLC与GCLM的相互作用在过表达AXIN1的HEK293T细胞中是增强的但在慢病毒介导AXIN1敲低的细胞中是减弱的
•     3.1.5 APAP可以诱导小鼠肝脏组织中AXIN1与GCL亚基的结合以及增强GCL两个亚基间的相互作用
•     3.1.6 AXIN1在APAP诱导GCL复合体形成的过程中十分重要
•   3.2 小结
•   3.3 讨论
• 参考文献
• 图表索引
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 游林茜

导师: 林圣彩

关键词: 肝毒性

来源: 厦门大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 厦门大学

分类号: Q75

总页数: 78

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