大豆同型半胱氨酸S-甲基转移酶（HMT）基因家族的进化与功能分化研究

论文摘要

甲硫氨酸是人类的必需氨基酸,主要从植物中获得。植物中甲硫氨酸主要以储存蛋白的形式存在于种子中。同型半胱氨酸甲基转移酶（HMT）是植物种子中甲硫氨酸合成的关键酶,在S-甲基甲硫氨酸或S-腺苷甲硫氨酸提供甲基的前提下,催化高半胱氨酸转化为甲硫氨酸。拟南芥中的研究发现,HMT基因家族的功能已经发生分化。为了探究HMT基因家族的进化历史,及其在人类主要植物蛋白来源大豆中的功能分化情况,本论文对该基因家族进行了详尽的分子进化和功能分化研究。研究结果如下:首先,植物HMT基因家族的系统进化关系显示,HMT基因家族在陆地植物的祖先开始分化为两个分支Class1和Class2,Class1中仅包含种子植物,而Class2中包含所有的陆地植物。进一步的基因结构分析结果显示,该基因家族在蛋白结构以及外显子与内含子数量和结构都相对保守;选择压力的分析也显示该家族在进化的过程中受到强烈的净化选择。尽管如此,功能分化的结果显示,Class1和Class2之间存在着type I功能分化,6个分化位点被检测到,type II功能分化并没有被检测到,这些结果暗示了HMT基因家族在进化的过程中相对保守,但可能存在着一定的非极性的亚功能分化。其次,表达分化是基因功能分化的一个重要反映。本研究对大豆中的4个HMT基因GmaHMT 1、GmaHMT 2、GmaHMT 3和GmaHMT 4分别进行了组织特异性表达和胁迫表达分析。组织特异性表达结果显示:GmaHMT 1、GmaHMT 2和GmaHMT3总体在生殖器官中的表达高于营养器官,在不同的发育阶段会出现一定的波动;不同的是,GmaHMT4主要在叶片中表达,在花以及不同时期的果荚中表达量显著降低。此外,大豆HMT基因家族的胁迫响应分析结果也具有不同的分化。首先,干旱胁迫中,GmaHMT 1、GmaHMT 2和GmaHMT3具有相似的响应结果,即低浓度时表达量显著下调,25%PEG6000时这些基因被诱导上调,而GmaHMT4在不同的浓度下均被显著下调;在盐胁迫下,4个基因的表达趋势与干旱胁迫相似,所不同的是,4个基因的表达在不同的盐浓度下均被显著下调;在酸碱胁迫下,大豆HMT基因家族在不同的pH条件下基本都被抑制,除了GmaHMT 1和GmaHMT3在pH为10条件下被诱导高表达。因此不同的基因在组织特异性表达和胁迫表达都有一定的分化。启动子区是影响基因表达的关键区域,通过大豆HMT基因启动子区域分析结果显示GmaHMT 1、GmaHMT 2和GmaHMT 3三个基因与GmaHMT 4的启动子区确实存在较大的分化,这可能也是影响GmaHMT 4与其他三个基因在组织和胁迫表达上分化的关键因素。最后,我们也对大豆中的HMT基因在Escherichia coli BL21（DE3）进行过表达发酵比较研究。结果显示,GmaHMT3和GmaHMT4产甲硫氨酸的含量显著高于GmaHMT1和GmaHMT2,其中GmaHMT2的产量最低。此外,我们还对4个HMT分别进行了催化分析,结果显示GmaHMT1不能利用SMM作为甲基供体合成甲硫氨酸,而GmaHMT2、GmaHMT3和GmaHMT4可以利用,该结果暗示了GmaHMTs在催化活性和甲基供体方面均已发生分化。综上,我们的研究结果显示植物中HMT基因家族在进化过程、基因表达、酶活以及甲基供体等方面都出现了一定程度的分化。这些分化与植物尤其是植物种子中甲硫氨酸的合成密切相关,这些研究将为植物尤其是大豆中甲硫氨酸的改良提供一定的理论基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
•   1.1 大豆中的甲硫氨酸
•     1.1.1 甲硫氨酸的作用
•     1.1.2 植物中甲硫氨酸的合成
•     1.1.3 植物甲硫氨酸改良研究进展
•   1.2 同型半胱氨酸S-甲基转移酶
•     1.2.1 同型半胱氨酸S-甲基转移酶概述
•     1.2.2 同型半胱氨酸S-甲基转移酶在拟南芥中的研究
•   1.3 植物基因家族分子进化
•     1.3.1 基因家族的概念
•     1.3.2 基因家族成员
•     1.3.3 基因家族分子进化研究
•   1.4 本文研究内容与意义
• 第二章 HMT基因家族的分子进化研究
•   2.1 引言
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 植物HMT基因家族序列的搜索与比对
•     2.2.2 植物HMT基因家族的系统发育分析
•     2.2.3 选择压力分析
•     2.2.4 序列结构分析与蛋白质基序的鉴定
•     2.2.5 功能分化分析
•   2.3 结果与讨论
•     2.3.1 植物HMT基因家族的分子进化关系
•     2.3.2 HMT基因家族的选择压力分析
•     2.3.3 植物HMT基因的基因结构分析
•     2.3.4 植物HMT基因的功能分化分析
•   2.4 本章小结
• 第三章 大豆HMT基因家族的表达分析
•   3.1 引言
•   3.2 实验材料
•     3.2.1 大豆材料
•     3.2.2 试剂与材料
•     3.2.3 溶液
•     3.2.4 主要仪器
•   3.3 实验方法
•     3.3.1 大豆材料的获取
•     3.3.2 胁迫处理
•     3.3.3 RNA的提取
•     3.3.4 cDNA的获取
•     3.3.5 引物设计
•     3.3.6 RT-PCR分析
•     3.3.7 启动子区分析
•   3.4 结果与讨论
•     3.4.1 RNA的提取与c DNA的获取
•     3.4.2 组织特异性表达分析
•     3.4.3 胁迫表达分析
•     3.4.4 启动子区分析
•   3.5 本章小结
• 第四章 大豆HMT基因家族的功能分析
•   4.1 引言
•   4.2 实验材料
•     4.2.1 菌种
•     4.2.2 质粒
•     4.2.3 试剂与材料
•     4.2.4 培养基
•     4.2.5 缓冲液
•     4.2.6 主要仪器
•   4.3 实验方法
•     4.3.1 感受态的制备
•     4.3.2 基因工程菌的构建
•     4.3.3 基因工程菌发酵
•     4.3.4 大豆HMT的诱导表达以及分离纯化
•     4.3.5 SMM与（R,S）-AdoMet的化学合成
•     4.3.6 大豆HMT催化SMM与（R,S）-AdoMet功能研究
•     4.3.7 pH、温度、金属离子对大豆HMT酶活影响
•     4.3.8 高效液相色谱（HPLC）分析与各物质标准曲线的制备
•   4.4 结果与讨论
•     4.4.1 GmaHMT/pEASY Blunt E1 表达载体的构建
•     4.4.2 SMM与（R,S）-AdoMet的化学合成
•     4.4.3 SMM与 L-Met标准曲线的制备
•     4.4.4 E.coli BL21（DE3）/pEASY Blunt E1-GmaHMT工程菌的发酵
•     4.4.5 大豆HMT催化分析
•     4.4.6 pH、温度、金属离子对大豆HMT酶活影响
•   4.5 本章小结
• 第五章 结论与展望
•   5.1 结论
•   5.2 展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介
•   1 作者简历
•   2 攻读硕士学位期间发表的学术论文
•   3 参与的科研项目及获奖情况
• 学位论文数据集

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 陈鹏

导师: 汪钊,赵嫚

关键词: 基因家族,分子进化,基因表达,大豆,功能分化

来源: 浙江工业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,生物学,农作物

单位: 浙江工业大学

分类号: Q943.2;S565.1

DOI: 10.27463/d.cnki.gzgyu.2019.000945

总页数: 86

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