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EZH2的一种新型异构体在生物体内的分布和功能研究

2020-12-08阅读(133)

EZH2的一种新型异构体在生物体内的分布和功能研究

论文摘要

可变剪接指同一基因在转录后,不同外显子的剪接形式使得同一基因的表达产物有着不同的剪接异构体,常对应着不同的功能。EZH2作为表观调控元件PRC2复合体的重要组成部分,参与细胞生命活动的调节。EZH2的剪接异构体在细胞内有着多种形式,一种被人们忽视的剪接异构体形式EZH2-X9在SD生物体内有着广泛表达,具体功能尚不明确。目的:1.分离鉴定出EZH2-X9型剪接异构体,对核酸序列、氨基酸序列进行比对分析;2.探究EZH2-X9型剪接异构体在细胞和SD大鼠中的表达分布以及随着个体发育过程中不同组织中表达量的变化;3.初步探究EZH2-X9型剪接异构体在细胞中与普通的全长EZH2相比功能上所具有的异同点。方法:1.在PC12细胞和SD大鼠中,通过PCR技术和基因测序寻找EZH2-X9剪接异构体的核酸表达,结合MUSCLE和BLAST对核酸及氨基酸序列进行分析;2.通过非放射性原位杂交技术（FISH）、免疫细胞化学技术（IF）、实时定量基因扩增荧光检测（q-PCR）以及蛋白质印记（WB）研究EZH2-X9剪接异构体在细胞内的表达以及分布;在SD大鼠中,通过特异性引物的设计和使用,q-PCR对不同组织中的mRNA表达分布进行研究,并利用WB检测蛋白表达的同步性。3.在未分化的PC12细胞中,结合基因工程的手段,通过荧光显微镜观察分析并统计细胞的变化,探究EZH2-X9剪接异构体对NGF诱导的细胞分化过程中所起到的具体功能影响。4.在PC12细胞内,通过降解同源序列靶基因mRNA的基因敲低（KD）方式,分别阻止普通EZH2-WT和EZH2-X9剪接异构体的表达,结合WB和蛋白质免疫共沉淀（IP）探究EZH2-WT和EZH2-X9剪接异构体在细胞内的功能差异性。结果:1.EZH2-X9在SD大鼠体内广泛分布,在细胞水平上EZH2-X9剪接异构体主要分布于细胞核内。2.在SD大鼠体内,EZH2-WT和EZH2-X9在不同组织中的表达量有着一定的差异性,脑中表达量和肺、心、肝相比较高;二者在同一组织中随着个体发育时间的增长而衰减,且蛋白表达量同步。3.在PC12细胞中分别过表达和KD二者后,在mRNA水平上发现二者有着相互影响;EZH2-X9对于组蛋白H3第27位赖氨酸的甲基化作用没有显著的影响,IP实验发现EZH2-X9能和EZH2-WT竞争结合EED,组成PRC2复合体;4.EZH2-WT和EZH2-X9对与细胞分化都有着重要的功能,在NGF诱导下未分化PC12细胞分化过程中,在KD-EZH2-X9时细胞的突起生长总长度、突起生长平均长度、突起生长数目、NOI%相比KD-EZH2-WT都有着更为显著的降低;KD-EZH2-X9会提高UIR1、MapLC3和GSK的表达。结论:1.EZH2-X9主要存在于SD大鼠的脑中,呈发育期差异表达;2.EZH2-X9和和EZH2-WT竞争结合EED,组成PRC2复合体却不能介导H3K27me3;3.EZH2-X9和EZH2-WT通过调控不同的靶基因和分子途径调节细胞生长。

论文目录

  • 致谢
  • 摘要
  • abstract
  • 第一章 绪论
  •   1.1 基因表达中的可变剪接、在细胞中的重要作用
  •   1.2 EZH2作为重要的表观调控元件对细胞的重要影响
  •   1.3 课题研究的主要意义及创新点
  •   1.4 实验思路及设计EZH2-X9细胞内分布
  • 第二章 EZH2-WT和异构体EZH2-X9序列对比
  •   2.1 实验材料
  •     2.1.1 实验仪器
  •     2.1.2 实验试剂和药品
  •     2.1.3 相关抗体
  •     2.1.4 相关引物
  •     2.1.5 实验动物
  •   2.2 实验方法
  •     2.2.1 PC12细胞培养
  •     2.2.2 细胞中总RNA提取
  •     2.2.3 反转录
  •     2.2.4 聚合酶链式反应（PCR）
  •     2.2.5 琼脂糖凝胶电泳
  •     2.2.6 荧光定量聚合酶链式反应
  •   2.3 数据分析
  •   2.4 实验结果
  •     2.4.1 EZH2在生物体内的各种剪接形式
  •     2.4.2 EZH2-WT和EZH2-X9核酸及氨基酸序列对比
  •   2.5 讨论
  • 第三章 EZH2-X9在细胞和SD大鼠体内的分布
  •   3.1 实验材料
  •     3.1.1 实验仪器
  •     3.1.2 实验试剂和药品
  •   3.2 实验方法
  •     3.2.1 PC12细胞培养
  •     3.2.2 非放射性原位杂交技术（FISH）
  •     3.2.3 免疫细胞化学实验（Immunohistochemistry）
  •     3.2.4 组织蛋白提取及蛋白浓度测定
  •     3.2.5 蛋白质免疫印迹（Western Blot）
  •     3.2.6 无内毒素质粒提取方法
  •     3.2.7 sh-EZH2-X9质粒、sh-EZH2-WT质粒构建
  •     3.2.8 Lipofectamine3000转染细胞
  •   3.3 数据分析
  •   3.4 实验结果
  •     3.4.1 EZH2-X9在细胞内的分布
  •     3.4.2 EZH2-X9在SD大鼠体内的分布及特点
  •   3.5 讨论
  • 第四章 EZH2-X9与EZH2-WT在生物体内有不同的分子机制
  •   4.1 实验材料
  •     4.1.1 实验仪器
  •     4.1.2 实验试剂及药品
  •     4.1.3 相关抗体
  •   4.2 实验方法
  •     4.2.1 PC12细胞培养
  •     4.2.2 细胞中总RNA提取与反转录
  •     4.2.3 荧光定量聚合酶链式反应（q-PCR）
  •     4.2.4 蛋白质免疫印迹（Western Blot）
  •     4.2.5 未分化PC12培养
  •     4.2.6 细胞存活率检测
  •     4.2.7 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）
  •   4.3 数据分析
  •   4.4 实验结果
  •     4.4.1 EZH2-WT和EZH2-X9对PC12细胞增殖的影响
  •     4.4.2 EZH2-WT和EZH2-X9对未分化PC2细胞诱导分化的影响
  •     4.4.3 EZH2-X9对组蛋白H3第27位赖氨酸甲基化的能力研究
  •     4.4.4 EZH2-X9在转录调节等方面的特殊的作用
  •   4.5 讨论
  • 参考文献
  • 硕士期间的学术活动及研究成果

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 李丹阳

    导师: 汪惠丽

    关键词: 可变剪接,神经分化

    来源: 合肥工业大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学

    单位: 合肥工业大学

    分类号: Q78

    总页数: 70

    文件大小: 6470K

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