定量PCR快速鉴别念珠菌种方法的建立

论文摘要

由于禽类念珠菌种类多样,具有条件致病和感染症状非典型的特性,在临床上区分定植和感染状态并确诊何种念珠菌感染是困难的。为了快速准确地检测禽类念珠菌感染和鉴别病原种类,本研究借助Primer Express 6.0软件设计目标念珠菌基因组DNA的种特异引物,采用real-time qPCR技术,通过检测不同念珠菌种的菌株培养物而建立鉴别方法,并用人工感染鸡的血液和肝脏样本对建立的方法进行检验。结果,成功找出三种念珠菌（白色念珠菌、光滑念珠菌和热带念珠菌）的3对特异引物和1对共用引物;特异引物分别形成相应种的特异熔解曲线,共用引物形成对应于3个种且明显分开的三条熔解曲线,与参照病原菌无交叉反应;该方法对念珠菌样本检测最低限度可达1×101copies/L以下,敏感度高于常规PCR约100倍以上;同种念珠菌不同模板浓度Tm值不变,同一浓度3个重复Ct值的变异系数小于2.5%,说明离散度较低,重复性好。所建方法可以通过对感染鸡的血液和肝脏样本的检测确定目标念珠菌感染和病原种类,检测周期约2～3 h。综上,通过适当的引物设计,采用定量PCR技术可以在一定范围内快速、准确、定量地检测和鉴别感染样本中的目标念珠菌种类。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1 试验菌种
•   1.2 试验动物
•   1.3 引物设计与合成
•   1.4 试验菌株基因组DNA的制备
•   1.5 引物特异性检验
•   1.6 标准阳性模板与标准曲线的制作
•   1.7 敏感性检验
•   1.8 重复性检验
•   1.9 动物感染及组织样本处理
•   1.1 0 组织样本目标菌的定量PCR检测
• 2 结果
•   2.1 特异性引物的设计
•   2.2 SYBR Green q PCR方法特异性
•   2.3 定量PCR标准曲线的建立
•   2.4 SYBR Green qPCR与普通PCR敏感性比较
•   2.5 重复性试验
•   2.6 感染组织目标菌的定量PCR检测
• 3 讨论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 刘建钗,柳焕章,刘彦威,张鹤平,宋阔阔,李聚芹,乔铁库,吴志勇

关键词: 特异引物,念珠菌,定量,熔解曲线,快速检测

来源: 中国兽医科学 2019年01期

年度: 2019

分类: 农业科技,基础科学

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 河北工程大学生命科学与食品工程学院河北省动物原食品安全检测技术工程实验室蛋鸡高效养殖岗,河北工程大学园林与生态工程学院,高邑县农牧局,武邑县农牧局,邯郸市畜牧技术推广站

基金: 河北省科技支撑项目(17226612D,HBCT2018150204),邯郸市科技计划项目(1622201050-2)

分类号: S852.66

DOI: 10.16656/j.issn.1673-4696.2019.0225

页码: 58-66

总页数: 9

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