构建重组枯草芽孢杆菌催化制备D-对羟基苯甘氨酸

论文摘要

目的:在Bacillus subtilis中表达异源D-海因酶基因（hyd）和D-氨甲酰水解酶基因（adc）,构建重组细胞作为催化剂,用于生产D-对羟基苯甘氨酸（D-HPG）。方法:构建hyd表达质粒,考察培养基中二价金属离子对D-海因酶活性的影响。过表达acoR基因,考察AcoR蛋白胞内水平与PacoA-hyd基因拷贝数的关系。筛选表达adc基因的启动子,构建hyd和adc基因共表达质粒,考察双酶活性菌株的催化特性。结果:成功构建了海因酶表达质粒pHPS和pUBS,培养基中添加0. 8mmol/L的MnCl2·4H2O,使168N/pUBS菌株的D-海因酶活性达到956U/gDCW。整合表达Pcdd-acoR基因,使LSL02/pUBS菌株的D-海因酶活性达到1 470U/gDCW。单拷贝PAE-adc基因的表达水平相对最高。双酶共表达质粒pUBSC被成功构建,菌株LSL02/pUBSC的最适催化温度为40℃～45℃,催化活性能够持续12h,当底物起始浓度为20g/L时,反应12h生成的D-HPG达到14. 32g/L,转化率达到95%,收率超过80%。结论:构建具有D-海因酶和D-氨甲酰水解酶双酶活性的重组Bacillus subtilis作为全细胞催化剂,用于海因酶法生产D-HPG,具有技术上的可行性和优势。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1 菌株和质粒
•   1.2 培养基及菌株培养方法
•   1.3 基因操作方法
•   1.4 qRT-PCR分析方法
•   1.5 胞内蛋白提取和SDS-PAGE分析
•   1.6 D, L-HPH转化反应及全细胞催化活性测定方法
• 2 结果和分析
•   2.1 D-海因酶基因在Bacillus subtilis中的表达
•   2.2 二价金属离子对D-海因酶活性的影响
•   2.3 acoR基因表达水平与D-海因酶活性的关系
•   2.4 D-氨甲酰水解酶基因在Bacillus subtilis中的表达
•   2.5 双酶共表达及培养基组分对催化活性的影响
•   2.6 菌株LSL02/p UBSC的催化特性
• 3 讨论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 李法彬,刘露,杜燕,班睿

关键词: 枯草芽孢杆菌,海因酶,氨甲酰水解酶,表达质粒,对羟基苯甘氨酸

来源: 中国生物工程杂志 2019年03期

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 天津大学化工学院天津大学系统生物工程教育部重点实验室

分类号: Q936

DOI: 10.13523/j.cb.20190310

页码: 75-86

总页数: 12

文件大小: 508K

下载量: 101