新城疫P蛋白磷酸化位点的质谱分析和功能鉴定

论文摘要

副黏病毒磷蛋白,即P蛋白（phosphoprotein）,富含丝氨酸和苏氨酸,在自然条件下磷酸化水平较高。副黏病毒P蛋白的磷酸化对病毒的转录和复制具有重要的作用,但新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）P蛋白磷酸化位点及其功能依然尚不明确。本研究通过LC-MS/MS质谱对NDV La Sota病毒P蛋白的磷酸化位点进行了检测,鉴定了Ser56、Ser77、Thr78、Thr82、Ser164和Ser141六个磷酸化位点。通过在线分析,预测这些磷酸化位点的磷酸化激酶分别是PKC、CKII和GSK3。为了鉴定6个磷酸化位点的生物学功能,在已建立的表达GFP基因的NDV微型基因组质粒pTVT-LGT基础上,用荧光素酶报告基因（luciferase）替换GFP报告基因,建立了表达荧光素酶的NDV微型基因组系统。利用"丙氨酸扫描"对6个磷酸化位点进行突变后,在NDV微型基因组平台中进行功能鉴定。结果显示,T78、T82和S164位磷酸化位点的缺失显著影响了病毒RNA依赖性RNA聚合酶复合体（RNA dependent RNA polymerase,RdRp）的复制,其生物学意义有待进一步的研究。

论文目录

• 1 材料和方法
•   1.1 病毒、细胞和质粒
•   1.2 主要试剂
•   1.3带荧光素酶报告基因的L a S o t a株微型基因组的构建
•   1.4 NDV La Sota微型基因组的活性检测
•   1.5 NDV P蛋白的质谱分析
•   1.6 生物信息学分析
•   1.7 P蛋白真核表达质粒的磷酸化位点突变
•   1.8 质谱的微型基因组验证
• 2 结果
•   2.1 SDS-PAGE电泳获取La Sota毒株P蛋白
•   2.2 P蛋白的质谱分析结果
•   2.3 微型基因组的构建和活性鉴定
•   2.4 磷酸化位点的功能检测
• 3 讨论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 李继红,徐腾飞,张耀丹,汪伟,孟春春,孙英杰,谭磊,宋翠萍,廖瑛,仇旭升,丁铲

关键词: 新城疫病毒,质谱,微型基因组,磷酸化位点

来源: 中国动物传染病学报 2019年05期

年度: 2019

分类: 农业科技,基础科学

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 中国农业科学院上海兽医研究所

基金: 国家重点研发计划重点专项(2016YFD0501603),国家自然科学基金(31101822,31530074)

分类号: S852.659.5

页码: 1-6

总页数: 6

文件大小: 1636K

下载量: 260