拟南芥褪黑素响应UV-B胁迫的功能和其合成酶表达研究

论文摘要

褪黑素是动植物体内重要的吲哚类信号物质,在植物中起着重要的作用。植物可以感知UV-B辐射,进而通过信号转导调节生长发育或者抵御伤害。为了研究植物褪黑素在UV-B胁迫中的作用及三个褪黑素合成酶在整个生命周期的功能,本研究首先成功获得拟南芥褪黑素合成酶ASMT（N-acetylserotonin methyltransferase）和COMT（caffeic acid O-methyltransferase）的过表达植株以及SNAT（Serotonin N-acetyltransferase）过表达植株SNAT1-OE、SNAT3-OE（不同剪切本）,同时筛选出SNAT的T-DNA插入突变体株系SALK032239,以及三种褪黑素合成酶ProSNAT::GUS、ProCOMT::GUS和ProASMT::GUS转基因株系。通过组织化学染色和qRT-PCR技术对拟南芥褪黑素三个合成酶的时空表达特性进行分析;并且分别对SNAT1-OE、SNAT3-OE、Col-0和snat拟南芥采用UV-B辐射（313nm）处理,运用qRT-PCR技术分析褪黑素合成酶基因ASMT、COMT和SNAT相对表达量及UV-B信号通路基因和UV-B效应基因表达情况;利用ELISA实验,检测了转基因植株在不同时间段处理下褪黑素的积累量;通过DAB（Diaminobenzidine）染色、NBT（Nitrotetrazolium blue）染色、H2O2含量检测、丙二醛（MDA）含量检测和电解质泄漏等生理实验,阐明了褪黑素对长时间UV-B胁迫具有抵抗作用。主要研究成果如下:（1）通过组织化学染色和qRT-PCR技术对三个拟南芥褪黑素合成酶基因表达模式分析发现,SNAT在拟南芥植株花器官和角果中表达量高;COMT不仅在拟南芥营养生长阶段表达量高,而且在生殖生长阶段表达量也很高;ASMT主要在根和花器官中表达。（2）为了研究褪黑素在UV-B胁迫中的作用,我们分别构建了pRI101-SNAT、pRI101-COMT和pRI101-ASMT植物双元表达载体,通过冻融法将重组载体成功转化至土壤农杆菌株GV3101,使用浸花法分别转化拟南芥Col-0,通过抗性筛选和基因组DNA初步鉴定确定35S::ASMT转基因植株16株、35S::COMT转基因植株8株、35S::SNAT1转基因植株20株、35S::SNAT3转基因植株9株,说明外源DNA均成功插入到拟南芥Col-0基因组中。通过qRT-PCR实验发现大部分过表达植株的mRNA相对表达量远大于Col-0;最后通过ELISA对过表达植株进行褪黑素含量检测,结果显示大多数转基因过表达株系的褪黑素含量上升1.5-2倍。通过PCR实验筛选得到SNAT纯合突变体SALK032239。选取AtSNAT的突变体和过表达转基因植株进行表型观察,Col-0的根长为4.6±0.16cm,snat的根长为3.47±0.25cm,SNAT1-OE与SNAT3-OE根长分别为5.2±0.17cm、5.3±0.13cm,这一结果表明,SNAT基因缺失导致根的生长受阻;SNAT基因过表达促进根的生长。在313nm UV-B辐射下,不同时间段分别处理SNAT的不同剪切本过表达株系SNAT1-OE、SNAT3-OE、Col-0和snat拟南芥。qRT-PCR结果表明,UV-B处理2h时,褪黑素合成酶基因SNAT、COMT、ASMT的mRNA相对表达量峰值远大于Col-0或者snat;ELISA实验结果发现,UV-B处理4h时,SNAT1、SNAT3过表达植株褪黑素含量分别是Col-0增幅的1倍和2倍,是snat突变体的3倍和3.2倍。同时,在褪黑素合成酶SNAT、COMT和ASMT基因和褪黑素含量方面,SNAT3-OE植株的表达都比SNAT1-OE显著。（3）我们通过qRT-PCR技术检测了UV-B信号通路相关基因表达情况,结果表明,与Col-0植株相比,SNAT过表达植株中HY5（ELONGATED HYPOCOTYL 5）的相对表达量明显上升,同时COP1（CONSTITUTIVELYPHOTOMORPHOGENIC 1）、HYH（HY5HOMOLOG）、RUP1（REPRESSOR OF UV-B PHOTOMORPHOGENESIS 1）和RUP2（REPRESSOR OF UV-B PHOTOMORPHOGENESIS 2）的相对表达量也明显上升;snat突变体植株中HY5的相对表达量最小。实验结果证明,SNAT基因可以影响UV-B信号通路,同时其下游效应基因APX（Ascorbate Peroxidase）、SAPX（Chloroplast APX）、CAT1（Catalase1）、CSD1（Cytosolic Superoxide Dismutase 1）的相对表达量提高,引发植物机体内ROS含量降低。DAB染色、NBT染色、H2O2含量测定结果表明在4h、6h时,过表达转基因植株体内ROS含量少于Col-0和snat;MDA含量测定结果表明在4h、6h时,过表达转基因植株体内MDA含量低于Col-0和snat;电解质泄露实验结果表明在2h、4h、6h,过表转基因植株的电导率值小于Col-0和snat。这些结果说明拟南芥体内褪黑素含量的增加提高了植株对于UV-B辐射的感知,并提高了抗性,同时SNAT的剪切本SNAT3-OE株系对于UV-B的抗性强于SNAT1-OE。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词汇总
• 第一章 绪论
•   1.1 褪黑素在植物中的功能
•   1.2 植物中的褪黑素合成路径
•   1.3 COMT基因功能
•   1.4 SNAT基因功能
•   1.5 ASMT基因功能
•   1.6 UV-B信号通路及其相关基因简介
•   1.7 研究的主要内容与意义
• 第二章 褪黑素合成酶基因重组过表达载体构建和转基因植株的获得
•   2.1 材料、菌种和载体
•   2.2 主要试剂与溶液
•   2.3 引物设计
•   2.4 实验方法
•     2.4.1 pRI101-AN重组载体的构建
•     2.4.2 过表达转基因植株的获得
•     2.4.3 过表达转基因植株鉴定
•     2.4.4 拟南芥过表达转基因植株的RNA提取与反转录
•     2.4.5 qRT-PCR实验
•     2.4.6 拟南芥过表达转基因植株的褪黑素含量测定
•     2.4.7 拟南芥SNAT的过表达转基因植株的表型观察
•   2.5 实验结果
•     2.5.1 拟南芥SNAT基因的CDS克隆
•     2.5.2 转化鉴定农杆菌GV3101 菌落PCR
•     2.5.3 过表达转基因株系的获得
•     2.5.4 SNAT过表达转基因植株表型观察
•   本章小结
• 第三章 拟南芥褪黑素响应UV-B胁迫的功能研究
•   3.1 材料
•   3.2 试剂与溶液
•   3.3 引物设计
•   3.4 实验方法
•     3.4.1 拟南芥突变体鉴定
•     3.4.2 AtSNAT的突变体和过表达转基因株系的表型观察
•     3.4.3 UV-B辐射处理
•     3.4.4 qRT-PCR表达分析
•     3.4.5 褪黑素含量的测定
•     3.4.6 拟南芥植株的DAB染色
•     3.4.7 拟南芥植株的NBT染色
•     3.4.8 拟南芥植株丙二醛含量测定
•     3.4.9 拟南芥植株的过氧化氢含量测定
•     3.4.10 电解质泄露的测定
•   3.5 实验结果
•     3.5.1 突变体鉴定
•     3.5.2 表型观察
•     3.5.3 UV-B对褪黑素合成酶与UV-B信号通路基因表达的影响
•       3.5.3.1 UV-B胁迫对褪黑素合成酶基因表达的影响
•       3.5.3.2 UV-B胁迫对UV-B信号通路基因表达的影响
•     3.5.4 DAB染色结果
•     3.5.5 NBT染色结果
•     3.5.6 褪黑素含量测定
•     3.5.7 过氧化氢含量测定
•     3.5.8 丙二醛含量测定
•     3.5.9 电解质泄漏的测定
•     3.5.10 下游效应基因的表达
•   本章小结
• 第四章 拟南芥褪黑素合成酶SNAT、COMT、ASMT的表达研究
•   4.1 材料、菌种与载体
•   4.2 主要试剂与溶液
•   4.3 引物设计
•   4.4 实验方法
•     4.4.1 β-葡萄糖醛酸酶（GUS）活性检测
•   4.5 实验内容
•     4.5.1 SNAT、COMT和 ASMT的 GUS表达活性研究
•     4.5.2 通过qRT-PCR技术对SNAT、COMT、ASMT进行组织表达分析
•   4.6 实验结果
•     4.6.1 SNAT、COMT、ASMT的 GUS染色
•     4.6.2 SNAT、COMT、ASMT的组织表达分析
•   本章小结
• 讨论
• 参考文献
• 附录 各种培养基和溶液配置
• 攻读硕士学位期间取得的学术成果
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 马征

导师: 黄萱

关键词: 褪黑素,褪黑素合成酶,信号通路,非生物胁迫,表达分析

来源: 西北大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 西北大学

分类号: Q943.2

总页数: 88

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