导读:本文包含了杂色曲霉素论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:曲霉,杂色,黄曲霉,毒素,毒理学,细胞,上皮细胞。
杂色曲霉素论文文献综述
凌阿茹,郭文博,杨俊花,赵志辉,郭晋丽[1]（2018）在《QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法同时测定畜禽组织中6种黄曲霉毒素和杂色曲霉素》一文中研究指出建立了QuEChERS前处理技术结合超高效液相色谱-串联质谱(UHPLC-MS/MS)检测畜禽组织中6种黄曲霉毒素和杂色曲霉素残留的分析方法。样品经20μLβ-葡萄糖苷酶酶解和10 mL乙腈-水(84∶16,v/v)提取,然后用1.0 g氯化钠和1.0 g无水硫酸镁净化、5 mL正己烷脱脂,最后采用1 mL含5 mmol/L乙酸铵的乙腈-水溶液(80∶20,v/v)复溶。以甲醇和5 mmol/L乙酸铵为流动相,在多反应监测正离子模式下进行检测,采用基质匹配标准曲线外标法进行定量分析。结果显示,6种黄曲霉毒素和杂色曲霉素在各自的范围内线性关系良好,相关系数(R~2)>0.99,检出限(LOD,S/N=3)为0.007~0.30μg/kg,定量限(LOQ,S/N=10)为0.02~0.91μg/kg,加标回收率为77.3%~118.5%(n=6)。该法简单、快速,灵敏度高,适用于不同畜禽产品中6种黄曲霉毒素和杂色曲霉素的确证分析。(本文来源于《色谱》期刊2018年05期）
张东辉[2]（2015）在《ATM/p53通路在杂色曲霉素诱导人胃黏膜上皮细胞(GES-1)G_2期阻滞中的作用》一文中研究指出杂色曲霉素(sterigmatocystin,ST)是一种致癌性真菌毒素,在人类食物中污染非常广泛。我们前期研究发现,ST可诱导人胃黏膜上皮细胞G2期阻滞。普遍认为各种理化因素引发的DNA损伤与细胞周期阻滞和细胞凋亡关系密切。为了进一步探讨ST诱发GES-1细胞G2期阻滞的机制,本实验研究了ST诱导的DNA损伤及损伤下游的ATM/p53信号通路的激活情况。(本文来源于《中国病理生理杂志》期刊2015年10期）
江飞剑,王海彬,杨承刚,韦国栋,柯世省[3]（2015）在《杂色曲霉素双抗夹心ELISA检测方法的建立》一文中研究指出杂色曲霉素在自然界广泛存在,毒性强,可经过多种途径吸收,诱发人和动物产生肿瘤,从而造成极大危害,研究发现肝癌、胃癌高发区的粮食中杂色曲霉素的检出量及检出率明显高于上述肿瘤低发区。本研究旨在寻找快速简单的方法检测谷物饲料中的杂色曲霉素,通过传统小鼠单克隆抗体和噬菌体库抗体的制备,建立检测谷物中杂色曲霉素的酶联免疫吸附测定方法 enzyme link immuno sorbent assays(ELISA)。(本文来源于《吉林农业》期刊2015年07期）
姜秀娟[4]（2015）在《杂色曲霉素诱导人胃黏膜上皮细胞(GES-1)发生G_2期检测点适应及可能机制的研究》一文中研究指出杂色曲霉素(Sterigmatocystin,ST)主要是杂色曲霉和构巢曲霉产生的毒性代谢产物。ST在自然界中广泛存在,主要污染玉米、花生、大米和小麦等谷物。研究证实ST具有致畸性、致突变性和致癌性,国际癌症研究中心(IARC)将ST列为“可能的人类致癌物”。动物实验研究表明,ST可诱导实验动物肺腺癌和胃粘膜异型增生,可以诱导大鼠骨髓细胞染色体畸变。体外实验表明,ST可直接诱导多种人类细胞,包括人肺癌细胞(A549)、人食管上皮细胞(Het-1A)、人胃粘膜上皮细胞(GES-1)等的DNA损伤,ST还可与细胞DNA结合形成加合物。因此,不少学者认为ST对DNA的损伤作用可能是其重要的致癌机制。DNA是遗传物质的基础,常受内外环境中各种有害因素的刺激而造成损伤。DNA损伤发生之后,细胞周期检测点即被激活。细胞周期检测点是调控细胞增殖周期的限速点,它的主要功能是识别DNA损伤并通过信号传导系统将DNA损伤信息传导到下游效应因子使细胞阻滞在G1、S或G2期,为DNA损伤修复提供充足的时间。损伤细胞DNA修复成功即可重新进入细胞周期,此过程被称为“恢复”。在这个过程中所有损伤均被完全修复,细胞能够正常分裂,而不会有将损伤的基因组传递给子代的风险。当DNA损伤不能被完全修复时,细胞会启动凋亡程序清除过度受损和有潜在危险性的细胞。细胞周期检测点的破坏和缺陷会导致基因组的不稳定性甚至肿瘤形成。值得注意的是DNA修复和凋亡并非所有DNA损伤细胞的必然通路,部分DNA损伤细胞能够逃脱DNA损伤导致的细胞周期阻滞,在DNA损伤没有修复的情况下进行细胞分裂,称之为“检测点适应”。检测点适应是介于细胞周期阻滞和细胞死亡之间的一个步骤,虽然多数发生检测点适应的细胞注定是要死亡的,但是有学者发现一小部分细胞经过检测点适应之后存活了下来并且开始增殖,这些带有损伤DNA的细胞具有基因结构的变异,其增殖生长可能与肿瘤发生有关。本实验室前期研究证实,ST可以诱导永生化人胃粘膜上皮细胞(GES-1)发生DNA损伤以及G2期阻滞和细胞凋亡。但是ST引起DNA损伤后能否发生检测点适应?如果ST能够诱导检测点适应的发生,其在ST诱导G2期阻滞中的作用和可能后果是什么?为了解决这些疑问,本实验在前期研究的基础上,探讨ST引发GES-1细胞发生G2期阻滞之后细胞的发展变化。研究分为叁部分,第一部分观察ST对GES-1细胞周期分布的影响,探讨持续的G2期阻滞之后GES-1细胞是否发生了检测点适应。第二部分从检测点信号传导通路的角度探讨检测点适应的可能机制。首先研究ST作用于GES-1细胞后,是否激活了ATR-Chk1信号途径,进而探讨Chk1在ST诱导GES-1发生检测点适应中的作用及其可能的分子机制。第叁部分通过研究ST对有丝分裂进入和退出的影响及其与PLK1表达的相关性,分析PLK1在ST引发G2期阻滞及检测点适应变化中的可能作用。本研究结果为揭示ST导致肿瘤发生的机制提供了一个新的线索。为胃癌的防治和治疗奠定了理论基础。第一部分ST对GES-1细胞G2期检测点的影响目的:探讨ST处理对GES-1细胞增殖的影响,进一步验证ST对GES-l细胞周期的阻滞作用,探讨ST诱导GES-1细胞周期阻滞过程中是否出现细胞周期检测点适应。方法：1采用噻唑蓝(MTT)比色法观察不同浓度(0-48μM)ST作用24、48、72及96 h对GES-1细胞增殖的影响。2采用流式细胞定量检测技术(FCM)分析ST作用下,GES-l细胞周期分布及有丝分裂标志蛋白p-H3(Ser-10)的表达情况。3采用相差倒置显微镜观察ST处理不同时间GES-l细胞形态学改变。4采用Western Blot方法检测通过物理震荡方法获得的增大变圆细胞γH2AX的表达及G2期关键调控因子的蛋白表达。5采用激光共聚焦免疫荧光技术观察ST处理对Cyclin B1、p-H3与γH2AX表达的影响。结果：1不同浓度ST对GES-1细胞增殖的影响分别用1μM、3μM、6μM、12μM、24μM和48μM ST作用于GES-l细胞24 h、48 h、72 h和96 h之后,采用MTT法检测细胞生存率。结果显示:在0-48μM浓度范围内,随ST作用浓度的增加,GES-1细胞存活率较溶剂对照组明显降低(r24 h=-0.968,r48 h=-0.985,r72 h=-0.992,P<0.05);在0-96 h时间范围内,随ST作用时间的延长,GES-1细胞存活率也较溶剂对照组明显下降(r6μM=-0.976,r12μM=-0.980,r24μM=-0.981 P<0.05)。ST作用48 h对GES-1细胞的半数抑制浓度IC50值为366.18μM;96 h,IC50值为9.87μM。研究结果提示ST以剂量时间依赖的形式抑制GES-1细胞的生存率。综合考虑不同浓度和时间ST处理后GES-1细胞增殖抑制情况,选取12μM ST为后续实验的条件。2 ST处理GES-1细胞不同时间对细胞周期分布的影响FCM结果显示,与本研究组前期实验结果相同,12μM ST处理GES-1细胞24 h及48 h,细胞周期中G2/M期细胞比例均较溶剂对照组明显增加,且ST 48 h处理组G2/M期细胞百分数明显高于ST 24 h处理组(P<0.05)。进一步证实了ST处理可以诱导GES-1细胞发生G2/M期阻滞。3 ST处理GES-1细胞不同时间对有丝分裂标志蛋白p-H3(Ser-10)表达的影响p-H3(Ser-10)为有丝分裂期标志蛋白,其阳性表达细胞代表有丝分裂期(M期)细胞。为进一步确定ST诱导GES-1细胞周期阻滞的确切期别,在上述研究的基础上,采用FCM方法进行了p-H3阳性表达细胞计数。结果显示ST处理24 h,GES-1细胞p-H3表达阳性细胞数明显低于溶剂对照组;但ST处理48 h后,p-H3表达阳性细胞数明显高于溶剂对照组(P<0.05)。研究结果提示ST处理24 h诱导GES-1细胞发生G2期阻滞,但经过持续的G2期阻滞之后,ST处理48 h已有部分细胞开始分裂,逐渐进入M期。4 ST处理不同时间GES-1细胞形态学改变倒置显微镜观察显示,对照组GES-1细胞呈扁平多角形,紧密贴壁;ST作用24 h,GES-1细胞形态未见明显变化;ST作用48 h,贴壁生长的GES-1细胞中出现多个体积增大变圆的细胞,细胞折光性明显增高,贴壁不紧密,用物理震荡方法处理(吸管轻轻吹打)细胞即可与贴壁细胞分离。5物理震荡方法获得增大变圆细胞的免疫表型分析为了证实ST处理48 h体外培养GES-1细胞中增大变圆细胞是否为有丝分裂期细胞,本研究采用物理震荡方法收集此类细胞,对比观察此类细胞和物理震荡后仍贴壁的细胞细胞周期分布情况。FCM检测结果表明,通过物理震荡方法收集到的增大变圆细胞G2/M期细胞比例高达74%,留下的贴壁细胞G2/M期细胞比例为45.7%(P<0.05)。增大变圆细胞有丝分裂期标志蛋白p-H3(Ser-10)表达阳性细胞比例达到77.1%,而留下的贴壁细胞p-H3(Ser-10)表达阳性的细胞数仅占到0.534%(P<0.05)。结果证实ST处理48 h后,增大变圆的GES-1细胞主要为有丝分裂期细胞。我们进一步检测增大变圆的细胞G2期关键调控因子的表达情况。Nocodazole是一类细胞微管抑制剂,可使细胞同步化到有丝分裂期,我们设立Nocodazole组为有丝分裂细胞阳性对照。Western Blot结果表明,通过物理震荡方法获得的增大变圆细胞p-Cdc2表达明显低于ST处理组及adherent组(P<0.05),与溶剂对照组及Nocodazole阳性对照组无显着差异(P>0.05);增大变圆细胞Cyclin B1表达明显高于溶剂对照组(P<0.05),与Nocodazole阳性对照组表达相似(P>0.05)。结果表明,ST作用于GES-1细胞48 h后增大变圆的细胞G2期关键调控因子p-Cdc2和Cyclin B1的表达与Nocodazole组相似,符合有丝分裂细胞蛋白表达特点。综合以上研究结果,ST处理GES-1细胞48 h,部分细胞突破G2期检测点,开始进入有丝分裂期。6 ST处理48 h对Cyclin B1表达的影响Cyclin B1是一种与细胞分裂相关的蛋白,它在有丝分裂早期从细胞浆向细胞核转移。激光共聚焦结果显示,溶剂对照组细胞表达Cyclin B1,且主要定位于细胞浆。ST处理48 h后,Cyclin B1细胞核表达有所增加。证实ST处理48 h部分细胞开始进入有丝分裂期。7 ST处理GES-1细胞后,进入有丝分裂期细胞γH2AX焦点的表达情况γH2AX焦点是DNA双链断裂损伤的一个分子标记物。为了明确ST处理的GES-1细胞是否携带损伤的DNA进入有丝分裂期,我们检测这些细胞γH2AX的表达情况。激光共聚焦结果显示,ST作用24 h和48 h后,大部分p-H3表达阳性的有丝分裂细胞γH2AX表达阳性。每组计数100个有丝分裂细胞,统计溶剂对照组、ST作用24 h和48 h处理组GES-1细胞的γH2AX的焦点数目。与溶剂对照组相比,ST处理组中有丝分裂细胞γH2AX的焦点数目明显增多,且ST 48 h处理组明显多于ST 24 h处理组(P<0.05)。为了进一步验证ST处理组中增大变圆细胞的DNA损伤情况,我们对比观察ST处理48 h后物理震荡法收集的增大变圆细胞和物理震荡后仍贴壁细胞的γH2AX蛋白表达情况,同时设立Nocodazole组为有丝分裂细胞阳性对照。Western Blot结果显示,与溶剂对照组相比,ST处理48 h,GES-1细胞γH2AX的蛋白表达水平增高(P<0.05),同时通过物理震荡的方法收集到的增大变圆细胞高度表达γH2AX,其表达水平明显高于ST处理组、adherent组以及Nocodazole组(P<0.05)。以上结果表明,ST诱导持续的G2期阻滞之后,GES-1细胞带着损伤的DNA进入有丝分裂,证实G2期检测点适应发生在ST处理的GES-1细胞。综合以上结果,ST诱导GES-1细胞DNA损伤及持续的G2期阻滞之后,部分细胞携带着未修复的DNA进入有丝分裂期,因此检测点适应存在于ST处理的GES-1细胞。第二部分Chk1在ST诱导GES-1细胞G2期检测点适应中的作用目的:ATR和Chk1是细胞周期检测点这一复杂的信号转导系统中的重要组件。DNA出现损伤时,ATR-Chk1信号通路即被激活,激活的Chk1将信号传递给Cdc25C磷酸酶和Cdc2使细胞周期阻滞在G2期。研究表明,Chk1的脱磷酸化在肿瘤细胞G2期检测点适应过程中发挥重要作用。本研究第一部分发现ST处理48 h,GES-1细胞发生G2期检测点适应现象,为探讨ST诱导GES-1细胞G2期检测点适应的可能机制,我们从检测点信号传导通路的角度探讨了Chk1在ST诱导GES-1细胞G2期检测点适应中的作用。方法：1采用Western Blot和荧光实时定量PCR(Real-time PCR)方法检测ST处理后ATR-Chk1信号通路相关分子在蛋白水平和m RNA水平上的表达情况。2采用倒置显微镜观察Chk1 si RNA干扰对ST处理后GES-1细胞形态学改变的影响。3采用FCM技术分析Chk1 si RNA干扰对ST处理后GES-1细胞周期分布及有丝分裂标志蛋白p-H3表达的影响。4采用激光共聚焦免疫荧光技术观察Chk1 si RNA干扰对ST处理后GES-1细胞p-H3表达及Cyclin B1核转位的影响。5采用Western Blot方法检测G2期检测点适应的GES-1细胞Chk1蛋白表达及磷酸化水平。6采用Western Blot和Real-time PCR方法检测ST处理后,GES-1细胞G2期关键调节因子及p53-p21信号通路相关基因在m RNA水平及蛋白水平的表达情况,采用Western Blot方法检测Chk1 si RNA干扰对G2期关键调控因子及p53-p21信号通路相关蛋白表达的影响。结果：1不同浓度ST对GES-1细胞ATR-Chk1信号通路相关基因的影响Real-time PCR结果表明,不同浓度ST处理GES-1细胞24 h(3μM、6μM、12μM),ATR和Chk1的m RNA表达量有所增加,尤其12μM ST处理组明显高于溶剂对照组(P<0.05)。Western Blot结果显示,ST处理GES-1细胞24 h,ATR的蛋白表达水平较溶剂对照组无明显差别(P>0.05),但是ATR的磷酸化水平和Chk1的蛋白表达水平及不同位点的磷酸化水平均明显高于溶剂对照组(P<0.05)。以上结果提示ST处理GES-1细胞24 h,启动了ATR-Chk1信号通路。2 ST对GES-1细胞ATR-Chk1和ATM-Chk2信号通路激活的交叉性分析不同DNA损伤之后,ATR-Chk1和ATM-Chk2信号通路经常有交叉激活现象,因此我们需要检测ST诱导DNA损伤之后Chk1的高表达和磷酸化是由ATR亦或ATM介导的。ATR si RNA干扰效率的检测:Real-time PCR和Western blot结果显示:ATR si RNA可以显着降低GES-1细胞中ATR在m RNA和蛋白水平的表达(P<0.05)。Western blot结果显示:ATR si RNA可以显着降低Chk1的磷酸化水平(P<0.05),但不能降低ATM的蛋白水平(P>0.05)。研究结果表明ATR si RNA序列对ATR表达的抑制具有特异性,同时ATR调控Chk1的磷酸化水平。前期实验研究证实ST可以诱导GES-1细胞ATM-Chk2信号途径的磷酸化激活,KU55933是ATM特异性抑制剂,Western Blot检测结果表明,KU55933预处理+12μM ST处理组中p-ATM及p-Chk2与12μM ST单独处理组相比明显降低(P<0.05),但是p-Chk1却没有下降。表明KU55933预处理可以阻断GES-1细胞中ST引发的ATM-Chk2信号途径的激活,但并不能抑制Chk1的磷酸化水平。提示ST诱导的Chk1活化不是由ATM介导的。综合以上结果,ST诱导GES-1细胞ATR-Chk1信号通路的激活,并且Chk1的激活依赖于ATR,但并不依赖于ATM。3 Chk1 si RNA干扰对ST处理GES-1细胞的细胞周期分布的影响Chk1 si RNA干扰效率的检测:Real-time PCR及Western blot分析结果表明:Chk1 si RNA可以显着降低GES-1细胞Chk1在m RNA及蛋白水平的表达(P<0.05)。FCM结果表明,Chk1 si RNA+ST 24 h处理组中G0/G1期的细胞比例比Control si RNA+ST 24 h处理组明显升高,而G2/M期细胞比例则明显下降(P<0.05)。以上结果证明Chk1 si RNA转染可以部分逆转ST诱导的GES-1细胞的G2/M期阻滞。4 Chk1 si RNA干扰对ST处理GES-1细胞有丝分裂进入的影响倒置显微镜观察显示,与Control si RNA+12μM ST处理组相比,Chk1si RNA+12μM ST处理组出现大量相对增大变圆的细胞,此类细胞贴壁不紧密,容易被摇脱,复合典型的有丝分裂期细胞形态学特征。激光共聚焦结果显示Chk1 si RNA+ST 24 h处理组细胞有丝分裂标志蛋白p-H3阳性表达的细胞数明显多于Control si RNA+ST 24 h处理组(P<0.05)。FCM研究结果进一步表明Chk1 si RNA+ST 24 h处理组p-H3阳性细胞数高达13.9%,而Control si RNA+ST 24 h处理组仅为3.15%(P<0.05)。综合以上结果,Chk1是ST诱导G2期阻滞的关键因子,Chk1的敲除使得G2期检测点失活,大量细胞携带损伤的DNA进入有丝分裂,发生检测点适应。5物理震荡方法获得增大变圆细胞Chk1表达及磷酸化情况Chk1 si RNA干扰实验结果提示Chk1低表达有利于GES-1细胞突破G2期检测点,携带未修复的DNA进入有丝分裂。我们进一步通过物理震荡方法获得ST作用48 h后增大变圆的细胞,检测Chk1表达,并用其磷酸化抗体检测其磷酸化水平,同时设立Nocodazole组为有丝分裂细胞阳性对照。Western Blot结果显示,12μM ST处理GES-1细胞48 h后,ST处理组Chk1的蛋白水平及磷酸化水平均较溶剂对照组明显升高(P<0.05),而物理震荡获得的增大变圆细胞Chk1的蛋白水平及磷酸化水平均明显低于ST处理组(P<0.05)。研究结果表明经ST处理后突破G2期检测点的GES-1细胞具有Chk1的低表达的特点。提示Chk1的低表达与损伤细胞发生G2期检测点适应密切相关。6 Chk1 si RNA干扰对ST处理GES-1细胞G2期关键调控因子的影响Western Blot结果显示,不同浓度ST(3μM、6μM、12μM)处理GES-1细胞24 h,可以显着上调Cdc25C及Cdc2的磷酸化水平和Cyclin B1的蛋白表达水平(P<0.05)。进而检测Chk1 si RNA干扰对ST作用之后GES-1细胞G2期关键调控因子的影响,Western Blot结果显示,较之Control si RNA+ST 24 h处理组,Chk1 si RNA+ST 24 h处理组中Cdc25C和Cdc2的磷酸化水平和Cyclin B1的蛋白表达水平均明显降低(P<0.05)。以上研究结果表明Chk1 si RNA干扰可以部分逆转ST上调G2期调控蛋白的作用。提示Chk1 si RNA通过抑制G2期关键调控因子的表达,导致G2期检测点失活,促使GES-1细胞发生检测点适应。7 Chk1 si RNA干扰对Cyclin B1核转位的影响Cyclin B1是一种与细胞分裂相关的蛋白,它在有丝分裂早期从细胞浆向细胞核转移。激光共聚焦结果显示,Control si RNA+ST 24 h处理组细胞高度表达Cyclin B1,且主要定位于细胞浆。Chk1 si RNA+ST 24 h处理组细胞可见Cyclin B1细胞核表达明显增多。证实Chk1 si RNA干扰,促使Cyclin B1由细胞浆向细胞核转移,推进有丝分裂的进程。8 Chk1 si RNA干扰对ST处理GES-1细胞p53-p21信号途径的影响Real-time PCR结果表明,不同浓度ST(3μM、6μM、12μM)处理GES-1细胞24 h后,p53和p21的m RNA表达量均明显高于溶剂对照组(P<0.05)。Western Blot结果显示,ST处理GES-1细胞24 h后,p53的磷酸化水平以及p53和p21蛋白表达水平与溶剂对照组相比明显升高(P<0.05)。以上结果提示ST处理可以激活GES-1细胞的p53-p21信号通路。进一部检测Chk1 si RNA干扰对GES-1细胞p53-p21信号通路的影响。Western Blot结果显示,与Control si RNA+ST 24 h处理组相比,Chk1si RNA+ST 24 h处理组可显着下调p21蛋白水平(P<0.05),但p53的蛋白水平及磷酸化水平并无明显改变(P>0.05)。以上结果提示,Chk1通过调控p21的蛋白表达影响有丝分裂的进入,而此调控过程并不通过p53介导。综合以上实验结果,Chk1的低表达是调控ST处理后的GES-1细胞发生G2期检测点适应的关键。其机制可能是通过下调G2/M期关键调控因子(p-Cdc25C和p-Cdc2),促进Cyclin B1的核转位以及下调p21引发检测点适应。第叁部分PLK1在ST诱导GES-1细胞G2期检测点适应及有丝分裂退出目的:PLK1是一种广泛存在于真核细胞中的丝/苏氨酸激酶,是有丝分裂的重要调控因子。研究证实,PLK1是有丝分裂进入的分子关卡,PLK1激酶的活性对检测点适应的发生起到了至关重要的作用。我们的实验中发现ST诱导GES-1细胞发生G2期检测点适应,细胞携带损伤的DNA进入有丝分裂,而此过程是否与PLK1基因的表达有关尚待进一步研究。PLK1除了在G2-M期转换中起到重要作用外,有报道证实DNA损伤,可以抑制Plk1激酶活性并阻止有丝分裂退出过程。因此我们进一步探讨ST对GES-1细胞有丝分裂退出的影响及其与PLK1表达的相关性。方法：1采用FCM分析技术检测ST预处理对GES-1细胞的细胞周期分布及p-H3表达的影响。2采用Western Blot方法检测ST预处理对GES-1细胞PLK1蛋白表达及磷酸化水平的影响。3采用Western Blot方法检测ATR-Chk1信号通路对GES-1细胞PLK1及p-PLK1表达的影响。4采用Western Blot方法检测G2期检测点适应的GES-1细胞的PLK1蛋白表达及磷酸化水平。5 FCM分析技术检测ST不同处理方法对Nocodazole同步化的GES-1细胞释放后细胞周期分布的影响6采用Western Blot方法检测ST预处理对Nocodazole同步化的GES-1细胞释放后PLK1及Cyclin B1表达的影响。结果：1 ST处理对GES-1细胞细胞周期分布及PLK1及p-PLK1表达的影响首先通过检测ST处理GES-1细胞3 h、8 h和24 h后,γH2AX的蛋白表达情况来判断ST预处理对GES-1细胞的DNA损伤情况。Western Blot结果显示,12μM ST处理GES-1细胞3 h后细胞即出现明显的DNA损伤,且随着作用间延长,DNA损伤加重(P<0.05)。由于PLK1的表达及磷酸化激活主要在有丝分裂期,我们需要将GES-1细胞同步化到M期检测ST处理对PLK1影响。采用12μM ST分别预处理GES-1细胞3 h、8 h和24 h,之后用Nocodazole处理16 h,将细胞同步化到M期。首先检测ST预处理对Nocodazole同步化细胞的细胞周期分布的影响,FCM结果显示,与Nocodazole单独处理组相比,ST阻止Nocodazole同步化的GES-1细胞进入G2/M期,大量细胞阻滞在S期(P<0.05)。同时ST的干预,减少了Nocodazole同步化细胞中p-H3表达阳性的细胞数目(P<0.05)。Western Blot结果显示,经ST处理的Nocodazole同步化的细胞PLK1蛋白水平及磷酸化水平均明显低于Nocodazole单独处理组(P<0.05)。以上研究结果表明ST诱导的DNA损伤抑制PLK1的表达和激活,同时阻止了有丝分裂的进入。2 ATR-Chk1信号通路对GES-1细胞PLK1及p-PLK1表达的影响为明确ATM/ATR信号通路对ST处理的GES-1细胞PLK1的表达及活化的影响,采用5 m M Caffeine预处理GES-1细胞3 h后,给予12μM ST处理24 h,最后用100ng/ml Nocodazole 16 h将细胞同步化到M期。Western Blot结果显示,与12μM ST+Nocodazole处理组相比,Caffeine预处理+12μM ST+Nocodazole组PLK1蛋白水平及磷酸化水平均明显升高(P<0.05)。为了进一步检验Chk1在ST诱导的PLK1低表达中的作用,分别将Chk1 si RNA以及Control si RNA转染GES-1细胞,转染24 h后,给予ST处理24 h,最后用100ng/ml Nocodazole 16 h将细胞同步化到M期。与Control si RNA+12μM ST+Nocodazole处理组相比,Chk1 si RNA+12μM ST+Nocodazole组PLK1蛋白水平及磷酸化水平均明显升高(P<0.05)。以上研究结果表明ATR-Chk1信号通路调控ST处理后GES-1细胞的PLK1的表达及磷酸化。3检测点适应的GES-1细胞PLK1及p-PLK1表达情况ST作用48 h后,通过物理震荡方法分离增大变圆细胞和贴壁细胞。同时设立Nocodazole组为有丝分裂细胞阳性对照。Western Blot结果显示,物理震荡方法获得的增大变圆细胞PLK1的蛋白水平及磷酸化水平均明显高于正常对照组、ST处理组及adherent组(P<0.05)。其中增大变圆细胞PLK1表达与Nocodazole对照组无明显差异(P>0.05),但是p-PLK1表达尚高于Nocodazole对照组(P<0.05)。研究结果证实发生G2期检测点适应的细胞PLK1高表达同时被磷酸化激活。4 ST预处理对GES-1细胞有丝分裂退出的影响细胞完成有丝分裂后进入下一个细胞周期的G0G1期,即有丝分裂退出。细胞从有丝分裂期退出的过程受多种基因的调控。我们检测ST预处理对GES-1细胞有丝分裂退出的影响,并探讨其可能的分子机制。分别给予GES-1细胞12μM ST处理3 h、8 h和24 h之后用Nocodazole 16 h将细胞同步化到M期,最后,将细胞培养基换成正常DMEM培养基,分别释放4h和8h,检测ST对GES-1细胞有丝分裂退出的影响。FCM结果显示,经释放4 h和8 h后,Nocodazole单独处理组细胞很快进入G0/G1期,而ST+Nocodazole处理组细胞缓慢从G2/M期释放,但多数仍处于G2/M期,且ST作用时间越长,细胞从G2/M期释放的速度越缓慢(P<0.05)。Western Blot结果显示,与Nocodazole单独处理组相比,ST+Nocodazole组释放过程中,PLK1及Cyclin B1蛋白水平下降缓慢(P<0.05)。以上结果提示ST预处理可以阻止Nocodazole同步化细胞的有丝分裂退出,且此释放过程与PLK1及Cyclin B1的表达有关。5 ST对已经进入有丝分裂期的GES-1细胞有丝分裂退出的影响为研究ST对已经通过Nocodazole同步化细胞的有丝分裂退出的影响,先将GES-1细胞用Nocodazole处理16 h将细胞同步化到M期,之后对照组给予DMSO,处理组给予12μM ST作用3 h,最后,将细胞培养基换成正常DMEM培养基,分别释放4 h和8 h。FCM结果显示,经释放4 h和8 h后,Nocodazole+ST 3 h处理组细胞与Nocodazole+DMSO组细胞均很快进入G0/G1期,二者之间无显着差别(P>0.05)。提示12μM ST作用3 h虽然已经能够造成DNA损伤,但并不能影响已经进入M期细胞的有丝分裂退出。综合以上结果,ST诱导的DNA损伤通过抑制PLK1的表达及活化,影响有丝分裂的进入及退出。检测点适应的细胞出现PLK1的高表达及激活,因此PLK1的活化是ST诱导GES-1细胞发生G2期检测点适应的另一关键原因。结论：1 ST首先诱导GES-1细胞发生G2期阻滞,持续G2期阻滞之后,部分细胞携带未修复的DNA进入有丝分裂,发生检测点适应。2 ST诱导DNA损伤后,激活ATR-Chk1信号通路。Chk1的低表达是调控ST处理后的GES-1细胞发生G2期检测点适应的关键。其机制可能是通过下调G2/M期关键调控因子(p-Cdc25C和p-Cdc2),促进Cyclin B1的核转位以及下调p21引发检测点适应。3 ST诱导GES-1细胞DNA损伤,抑制PLK1的表达及活化,阻止有丝分裂的进入,此抑制作用是通过ATR-Chk1信号通路介导的;ST抑制GES-1细胞有丝分裂的退出,此干预作用与PLK1及Cyclin B1的表达密切相关;持续G2期阻滞之后,部分ST处理的GES-1细胞出现PLK1高表达及高度磷酸化,因此PLK1的活化是ST诱导GES-1细胞发生G2期检测点适应的另一关键原因。4 ST可能通过诱导GES-1细胞发生G2期检测点适应,引发细胞基因组不稳定性,甚至肿瘤形成。(本文来源于《河北医科大学》期刊2015-04-01）
刘洋,杜明,张根义[5]（2014）在《黄曲霉毒素B_1与杂色曲霉素对HepG2细胞的联合毒性》一文中研究指出研究了黄曲霉毒素B1(AFB1)和杂色曲霉素(ST)对人肝癌细胞Hep G2的细胞毒性及其联合毒性。体外培养人肝癌细胞Hep G2,用不同浓度梯度的AFB1(0.1、1、5、10μmol/L)和ST(0.5、2.5、5、7μmol/L)单独和联合作用于Hep G2细胞24 h或48 h,分别测量细胞活性、ATP含量、DNA受损程度、线粒体膜电位,以及活性氧含量的变化,通过统计分析得到两种毒素对Hep G2细胞的联合毒性作用。结果显示,AFB1和ST对Hep G2细胞的IC50分别为16.989μmol/L和7.258μmol/L,细胞增殖力、ATP、DNA、线粒体膜电位、活性氧等指标的理论加和值与实际值无显着性差异(P>0.05)。同时,这两种毒素及其混合物对Hep G2细胞的作用终点均可分为3类:第一类为细胞增殖力的降低;第二类包括ATP含量、DNA含量变化;第叁类为活性氧含量变化和线粒体膜通透性变化。表明AFB1和ST对Hep G2细胞的联合毒性作用为加和作用。(本文来源于《食品与生物技术学报》期刊2014年12期）
Li,M,谢冰[6]（2014）在《一种检测谷物和粮油作物中杂色曲霉素cELISA方法的建立》一文中研究指出杂色曲霉素(STG)是黄曲霉毒素B1在体内代谢的前体,其对人和动物的毒性作用及致癌作用是众所周知的,为得到STG的单克隆抗体,本试验利用一种可靠快速的方法将STG与BSA进行偶联,得到了STG的衍生物。以这种新合成的STG-BSA偶联物为抗原,通过改进的两步法HAT培养基进行筛选,最终得到3株敏感性、特异性良好的STG单克隆抗体,将其命名为VerA3、VerA4和VerA6。这3株单克隆抗体对STG有高度亲和力,而对黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2则无交叉反应。本试验利用最敏感的抗体株VerA3建立了一种超灵敏cELSIA法用于检测小麦、玉米、花生中的STG。包被原浓度为0.5μg/mL,抗体浓度1∶80000。对影响测定性能的几个物理因素,如pH、离子强度、封闭液及样品稀释液进行了优化。结果显示,该方法的检测限分别为小麦0.08ng/g、玉米0.06ng/g、花生0.1ng/g,批间和批内变异系数均小于10%,回收率为83%~110%。这些回收率与HPLC-MS/MS回收率(90%~104%)一致。结果表明该抗体VerA3在粗粮作物中STG含量的研究中是非常有用的。(本文来源于《中国畜牧兽医》期刊2014年10期）
刘洋[7]（2014）在《黄曲霉毒素B_1和杂色曲霉素对HepG2细胞的联合毒性》一文中研究指出粮食经常会发现有真菌毒素的存在，并且不同类型毒素会共同存在，而其共存后对人体的联合毒性并没有系统的认识，国家对于毒素共存后单种毒素的最大允许摄入量也没有明确的法律法规。本文选取较有代表性的真菌毒素—黄曲霉毒素B1（AflatoxinB1,AFB1）和杂色曲霉素（Sterigmatocystin，ST）进行联合毒性的研究，鉴于两种毒素都具有肝毒性，本试验选取HepG2细胞作为研究对象。经过AFB1和ST的单独和联合作用后，观察HepG2细胞的细胞内部各部位的损伤情况，细胞凋亡的程度以及凋亡相关的蛋白表达的变化。探讨AFB1和ST的单独和联合作用诱导HepG2细胞凋亡的作用机制以及二者的联合作用类型。将不同浓度的AFB1、ST以及其混合物加入处于对数期的HepG2细胞中进行处理，并且设置溶剂对照组（0.1%DMSO）。药物处理24h、48h后，观察细胞中细胞增殖率、ATP含量、DNA含量、线粒体膜通透性及活性氧含量5个指标的变化情况，并且分析两种毒素的联合作用。结果发现单独及联合作用时细胞的存活率、细胞的DNA含量、ATP含量的降低程度呈剂量相关性，而细胞内ROS的含量、线粒体膜通透性呈剂量依赖性增高。对各个指标的结果进行显着性分析表明，当AFB1和ST联合作用于HepG2细胞时表现为加和作用。选取AFB1、ST单独及联合染毒时对细胞增殖抑制率达到10%、30%和50%时的浓度为本章的实验浓度，并设置溶剂对照组（0.1%DMSO），药物处理48h后，观察细胞的形态变化，检测细胞线粒体膜电位的变化，细胞周期的变化以及细胞凋亡率。实验发现Hoechst33258染色后细胞出现浓染，表明有细胞凋亡的现象产生。AFB1、ST及其混合物都诱导HepG2细胞发生了细胞周期阻滞。单独作用时不同浓度的药物会诱导不同的周期阻滞，主要集中在G0/G1期和S期，联合作用时则同时诱导HepG2细胞发生G0/G1期阻滞和S期阻滞。同时，线粒体膜电位的下降及细胞凋亡率的增加均呈剂量相关性。两种毒素联合染毒后，细胞凋亡各个表征并没有比单独作用时明显增多或者减少，进一步证明两种毒素的联合作用为加和作用。采用细胞免疫组织化学染色检测AFB1、ST单独及联合作用时对HepG2细胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9及p53表达的影响。结果表明Bcl-2蛋白的阳性表达量呈剂量依赖性降低，Bax、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9及p53的阳性表达量随着毒素浓度的增加而增加。上述实验表明AFB1、ST单独及联合作用会对HepG2细胞的主要部位如DNA和线粒体造成损伤，并且引起细胞凋亡。综上所述，AFB1和ST联合作用于HepG2细胞时为加和作用。(本文来源于《江南大学》期刊2014-06-01）
高伟,刘晓芳[8]（2014）在《杂色曲霉素的毒理学研究进展》一文中研究指出杂色曲霉素(sterigmatocystin,ST),是含有双呋喃环的氧杂蒽酮类化合物,主要由构巢曲霉、杂色曲霉和离蠕孢霉产生[1]。该霉菌广泛存在于自然界,可污染多种粮食作物如大麦、小麦、花生、玉米、大豆和咖啡豆等,尤其对花生、玉米和小麦等饲料饲草污染更为严重。潮湿的居住环境中地毯和天花板中ST的检出率也明显升高[2]。有研究表明,在胃癌高发区患者胃液(本文来源于《毒理学杂志》期刊2014年01期）
夏晨妮[9]（2013）在《杂色曲霉素、乙醇联合染毒致人肝细胞Hep G2 DNA链断裂机制研究》一文中研究指出目的：研究发现杂色曲霉素(Sterigmatocystin,ST)作为继黄曲霉毒素之后的第二大真菌毒素，广泛存在于自然界中，可污染多种粮食作物，在ST污染严重的地区，居民患有胃癌和肝癌的机率高于其他地区。而乙醇的摄入在近些年来也逐渐增加，长期大量的饮酒可诱发多种疾病，尤其是肝损害。在日常生活中，人们可能同时摄入两种物质，我们猜想是否有毒物质的联合摄入比单一摄入对身体健康伤害更大。因此，本实验以体外实验为研究手段，探究乙醇和ST的联合处理是否可增加这2种毒物肝损伤程度；并从氧化应激和溶酶体膜稳定性两个方面来探讨其DNA损伤的机制。方法：实验体系选定人肝细胞Hep G2，实验步骤如下：1.采用MTT细胞存活率实验，确定染毒剂量；金正均法计算合并效应相关系数，确定两者相互作用关系。2.采用单细胞凝胶电泳（SCGE）实验检测Hep G2细胞DNA的损伤状况；用Hoechst33258染色检验细胞凋亡。3.采用2’，7’―二氢二氯荧光素（DCFH）染色法检测Hep G2细胞中ROS的水平。4.荧光色素吖啶橙（Acridineorange，AO）染色法测定Hep G2细胞内溶酶体膜的稳定性。5.应用SPSSv11.5统计软件包对实验结果进行统计分析。结果：1. MTT实验结果显示ST的IC50为10.1μg/mL，乙醇的IC50为1190.4μg/mL。乙醇240μg/mL和ST1μg/mL联合作用处理HepG2细胞24h后，联合系数为q=0.99，呈单纯相加作用。2. Hep G2细胞在ST0.5、1和2μg/mL分别处理0.5、1和2h，乙醇60、120和240μg/mL分别处理1h后引起DNA断裂，细胞出现彗星样的拖尾，尾长的增长同对照组相比呈剂量依赖关系，并具有统计学意义。联合处理0.5h后Hep G2细胞开始出现DNA损伤。ST和乙醇联合作用2h处理后，细胞损伤程度加剧且细胞凋亡的数量大于10%。3.ST、乙醇单独处理Hep G2细胞0.5h后可引起ROS生成量增加，联合处理组ROS的生成量与单独乙醇处理组相比增加。4.Hep G2细胞在ST单独处理1h或乙醇处理0.5h后，溶酶体膜稳定性开始发生变化。在不同剂量乙醇中联合使用1μg/mL ST染毒1h，可测得的细胞AO荧光强度达到顶峰，2h联合染毒处理组时发生回落，总体较乙醇单独染毒处理组有显着性差异。结论：与乙醇单独作用相比，杂色曲霉素和乙醇的混合处理会降低细胞存活率，增加Hep G2细胞DNA链断裂程度，加剧DNA损伤。其作用机制可能是乙醇和ST联合作用均可造成细胞损伤且其损伤一部分原因与溶酶体途径以及氧化应激途径有关。ST和乙醇联合处理可引起细胞内ROS的和AO荧光值强度的增加，且增加量与时间和剂量有一定的依赖关系。联合染毒处理2h后，细胞损伤继续加剧，与乙醇单独处理组相比，ROS生成量和AO荧光强度没有显着增加，AO荧光强度反而比乙醇单独作用减少，可能与凋亡细胞增多有关，这在彗星实验中也得到验证。因此ST和乙醇联合处理Hep G2细胞诱发DNA损伤加剧的原因可能一部分来自于氧化应激作用，一部分来自与溶酶体破裂对细胞DNA的直接损伤作用。(本文来源于《大连医科大学》期刊2013-05-01）
王娟[10]（2013）在《杂色曲霉素对永生化和原代培养人食管上皮细胞DNA损伤作用及细胞周期影响的研究》一文中研究指出杂色曲霉素（Sterigmatocystin，ST）是由杂色曲霉、构巢曲霉等真菌所产生的一种具有致癌性的真菌毒素，其污染非常普遍，广泛存在于小麦、玉米、豆类等粮食作物和面包、奶酪等食品中。此外，ST在环境中的污染也比较常见，有学者发现在潮湿房屋的地毯上和建筑材料中可以检出ST的污染。目前研究表明，ST可引起多种器官的损伤及致癌作用，国际癌症研究中心已将ST列为“可能的人类致癌物”。因此，ST暴露对机体的影响是值得关注的一个公共卫生问题。河北省南部太行山区是世界食管癌高发区之一，本课题组对河北省食管癌高发区居民饮食中真菌及其毒素污染状况进行了多年的监测分析，发现当地居民饮食中真菌毒素的污染很严重，其中ST是主要污染霉菌毒素之一，其污染率高达60.25%，平均含量达9.14μg/kg。前期的动物实验发现，长期食用该地区ST污染的饲料可以诱发实验动物出现食管癌前病变，提示ST的高污染可能是食管癌发生的重要危险因素。因此，有必要深入探讨ST对人食管上皮细胞的损伤作用。本研究在前期流行病学调查及动物实验的基础之上，利用永生化的人食管上皮细胞（Het-1A）和原代培养的人食管上皮细胞（EPC）作为研究对象，探讨ST对人食管上皮细胞的损伤作用。研究分为叁部分,第一部分首先观察ST对Het-1A细胞株DNA的损伤作用以及对DNA修复系统和细胞周期分布的影响，然后进一步探讨错配修复基因的作用。第二部分通过分离培养原代人食管上皮细胞，进一步研究ST对EPC细胞DNA的损伤作用以及对细胞周期的影响，并初步探讨了Het-1A细胞和EPC细胞发生不同周期阻滞的原因。第叁部分深入系统地研究了ATM-Chk2和p53-p21信号通路在ST诱导Het-1A细胞和EPC细胞周期阻滞中的作用。本研究结果为揭示ST暴露与人食管上皮损伤乃至食管癌发生的可能关系奠定了基础，对提高我国农村居民，特别是食管癌高发区居民食品安全水平具有重要意义。第一部分错配修复基因hMLH1在杂色曲霉素诱导DNA损伤导致Het-1A细胞发生G_2期阻滞中的作用目的：探讨错配修复基因hMLH1在ST诱导DNA损伤导致Het-1A细胞发生G_2期阻滞中的作用。方法：1采用流式细胞定量检测技术（FCM）、吉姆萨（Giemsa）染色和免疫荧光技术分析ST处理后Het-1A细胞周期分布情况。2采用蛋白质免疫印迹（Western Blot）和荧光实时定量PCR（Real time PCR）方法检测ST处理后G_2期关键调节因子—Cdc25C、Cdc2和CyclinB1在蛋白水平和mRNA水平上的表达情况。3采用免疫共沉淀技术检测Cdc2-CyclinB1复合物的形成情况。4采用碱性彗星实验观察ST处理后Het-1A细胞DNA损伤的情况。5采用Western Blot和Real time PCR方法检测ST处理后DNA修复基因在蛋白水平和mRNA水平上的表达情况。6采用FCM和Western Blot方法检测hMLH1siRNA干扰对细胞周期分布及细胞G_2期关键调控因子—Cdc25C、Cdc2和CyclinB1的影响。7采用碱性彗星实验观察hMLH1siRNA干扰对ST诱导Het-1A细胞DNA损伤的影响。结果：1ST对Het-1A细胞周期分布的影响FCM结果显示，6、12和24μM ST处理组Het-1A细胞G_2/M期的细胞比例较溶剂对照组明显增加（P<0.05）。吉姆萨染色结果显示，与溶剂对照组有丝分裂指数（MI）（8.02±0.59%）相比，12和24μM ST处理组细胞MI（5.77±0.23%和5.35±0.28%）明显降低（P<0.05）。免疫荧光结果显示24μM ST处理组细胞表达有丝分裂期标志蛋白p-H3（Ser-10）的细胞数明显少于溶剂对照组。以上结果表明，ST处理可以诱导Het-1A细胞周期发生G_2期阻滞。2ST对Het-1A细胞G_2期关键调节因子的影响Western Blot结果显示，ST处理可以上调Cdc25C、Cdc2和CyclinB1的蛋白表达水平，同时ST处理还可以升高Cdc25C和Cdc2的磷酸化水平。免疫共沉淀结果显示，ST处理组Cdc2-CyclinB1复合物的形成明显少于溶剂对照组。Real-time PCR结果显示ST处理可以上调Cdc25C、Cdc2和CyclinB1在mRNA水平上的表达（P<0.05）。3ST对Het-1A细胞DNA的损伤作用荧光显微镜下观察，可见溶剂对照组细胞呈圆形，少有“彗星”现象的发生，而24μM ST处理组细胞电泳后出现了较多的“彗星”现象，且彗星拖尾明显。经CASP软件进一步统计分析发现，ST处理组Het-1A细胞彗星的Tail DNA%、Tail Length及Olive Tail Moment值均明显高于溶剂对照组（P<0.05）。结果提示ST可以诱导Het-1A细胞DNA损伤。4ST对Het-1A细胞DNA修复系统的影响Real-time PCR结果表明，ST处理Het-1A细胞24h后，XPC、hMLH1和hMSH2的mRNA表达量均明显高于溶剂对照组（P<0.05），而ST处理组细胞内XRCC1、RAD51和DNA-PK的mRNA表达量与溶剂对照组相比均未发生明显变化（P>0.05）。提示ST诱导的DNA损伤可以启动核苷酸切除修复（NER）和错配修复（MMR）系统。为了进一步验证ST对MMR系统的影响，我们采用Western Blot方法观察了ST处理Het-1A细胞后hMLH1和hMSH2蛋白的表达情况。结果显示，ST处理Het-1A细胞24h后，hMLH1和hMSH2蛋白的表达水平明显高于溶剂对照组（P<0.05）。5hMLH1siRNA和hMSH2siRNA干扰效率的检测hMLH1、hMSH2siRNA以及Control siRNA转染48小时后收集细胞。Real-time PCR和Western blot结果显示：hMLH1和hMSH2siRNA可以显着抑制Het-1A细胞hMLH1和hMSH2mRNA及蛋白的表达。上述结果表明，hMLH1和hMSH2siRNA序列可以明显干扰hMLH1和hMSH2在mRNA和蛋白水平的表达。因此，后续的实验中继续选择hMLH1和hMSH2siRNA序列进行研究。6hMLH1siRNA和hMSH2siRNA干扰对ST诱导Het-1A细胞G_2期阻滞的影响FCM结果显示，hMLH1siRNA+DMSO处理组，细胞周期分布与Control siRNA+DMSO处理组相比，没有明显变化（P>0.05）。与ControlsiRNA+24μM ST处理组相比，hMLH1siRNA+24μM ST处理组G_2/M期细胞比例则明显降低（P<0.05），但仍高于Control siRNA+DMSO处理组（P<0.05）。表明hMLH1siRNA转染可以部分降低ST诱导的细胞G_2/M期比例增高。然而有趣的是，hMSH2siRNA转染对ST诱导的Het-1A细胞G_2期阻滞无明显影响（P>0.05）。提示hMLH1的激活可能部分参与了ST诱导的Het-1A细胞G_2期阻滞，而hMSH2的激活并未参与G_2期阻滞的发生。7hMLH1siRNA干扰对Het-1A细胞G_2期调控蛋白的影响Western Blot检测结果显示，hMLH1siRNA+DMSO处理组细胞内Cdc25C、Cdc2和CyclinB1的蛋白表达水平以及Cdc25C和Cdc2的磷酸化水平与Control siRNA+DMSO处理组相比均没有明显差异（P>0.05）。与Control siRNA+24μM ST处理组相比，hMLH1siRNA+24μM ST处理组Cdc25C、Cdc2和CyclinB1的蛋白表达水平以及Cdc25C和Cdc2的磷酸化水平明显降低，但仍高于Control siRNA+DMSO处理组（P<0.05）。提示hMLH1siRNA干扰可以部分逆转ST上调G_2期调控蛋白的作用。8hMLH1在ST诱导DNA损伤导致Het-1A细胞G_2期阻滞中的作用模式采用碱性彗星实验方法观察hMLH1siRNA干扰对ST诱导Het-1A细胞DNA损伤的影响。结果显示，hMLH1siRNA+DMSO和ControlsiRNA+DMSO处理组细胞呈圆形，少有“彗星”现象的发生；而ControlsiRNA+24μM ST和hMLH1siRNA+24μM ST处理组细胞电泳后均出现了较多的“彗星”现象，两者无明显差异。经CASP软件进一步统计分析发现，与hMLH1siRNA+DMSO和Control siRNA+DMSO处理组相比，Control siRNA+24μM ST和hMLH1siRNA+24μM ST处理组Het-1A细胞彗星的Tail DNA%、Tail Length及Olive Tail Moment值均明显增高，但后两者之间相比无明显差异（P<0.05）。结果表明，ST诱导Het-1A细胞DNA损伤后，hMLH1并未导致二次损伤的发生。提示ST诱导Het-1A细胞DNA损伤后，hMLH1通过DNA损伤应答的普遍模式导致G_2期阻滞的发生。第二部分SV40大T抗原在杂色曲霉素诱导EPC细胞和Het-1A细胞发生不同周期阻滞中的作用目的：探讨SV40大T抗原（SV40LT）在ST诱导EPC细胞和Het-1A细胞发生不同周期阻滞中的作用。方法：1采用碱性彗星实验观察ST处理后EPC细胞DNA损伤的情况。2采用FCM技术分析ST处理后EPC细胞周期分布情况。3采用Western Blot方法检测ST处理EPC细胞和Het-1A细胞后G_1期关键调控因子的表达情况。4采用FCM和Western Blot方法检测SV40LT siRNA干扰对细胞周期分布及细胞G_1和G_2期关键调控因子的影响。结果：1ST对EPC细胞DNA的损伤作用荧光显微镜下观察，可见溶剂对照组细胞呈圆形，少有“彗星”现象的发生，而24μM ST处理组细胞电泳后出现了较多的“彗星”现象，且彗星拖尾明显。经CASP软件进一步统计分析发现，与对照组相比，ST处理组EPC细胞彗星的Tail DNA%、Tail Length及Olive Tail Moment值均明显高于溶剂对照组（P<0.05）。提示ST可以诱导EPC细胞发生DNA损伤。2ST对EPC细胞周期分布的影响FCM检测结果表明，与溶剂对照组相比，除6μM ST处理组外，12μM和24μM ST处理组EPC细胞G0/G_1期的细胞比例明显增加（P<0.05）。提示ST处理可显着影响原代培养的EPC细胞细胞周期分布，引起细胞G_1期阻滞。3ST对EPC细胞G_1期关键调控因子的影响Western Blot检测结果显示，与溶剂对照组相比，给予不同浓度ST作用24h后，EPC细胞Rb的蛋白表达水平和磷酸化水平以及E2F1的蛋白表达水平明显减少，同时ST处理可以下调CyclinD1、Cdk4、CyclinE1和Cdk2蛋白的表达水平（P<0.05）。4ST对Het-1A细胞G_1期关键调控因子的影响Western Blot检测结果显示，与溶剂对照组相比，给予不同浓度ST作用24h后，Het-1A细胞Rb的蛋白表达水平和磷酸化水平以及E2F1的蛋白表达水平明显增加，同时ST处理可以下调Het-1A细胞内CyclinD1和Cdk4蛋白的表达水平，同时上调CyclinE1和Cdk2蛋白的表达水平（P<0.05）。5SV40LT siRNA干扰效率的检测SV40LT siRNA以及Control siRNA转染48小时后收集细胞。Real-timePCR和Western blot结果显示：SV40LT siRNA可以显着降低Het-1A细胞SV40LT mRNA和蛋白的表达。上述结果表明，SV40LT siRNA序列可以明显干扰SV40LT在mRNA和蛋白水平的表达。因此，后续的实验中继续选择该siRNA序列进行研究。6SV40LT siRNA干扰对ST诱导Het-1A细胞发生G_2期阻滞的影响FCM结果显示，SV40LT siRNA+DMSO处理组，细胞周期分布与Control siRNA+DMSO处理组相比，没有明显变化（P>0.05）。与ControlsiRNA+24μM ST处理组相比，SV40LT siRNA+24μM ST处理组G0/G_1期细胞比例明显升高（P<0.05），而G_2/M期细胞比例则明显降低（P<0.05），但仍高于Control siRNA+DMSO处理组（P<0.05）。7SV40LT siRNA干扰对Het-1A细胞G_1期关键调控因子（Rb/p-Rb和E2F1）的影响Western Blot检测结果显示，SV40LT siRNA+DMSO处理组细胞内Rb的蛋白水平和磷酸化水平以及E2F1的蛋白表达水平与ControlsiRNA+DMSO处理组相比均没有明显差异（P>0.05）。与Control siRNA+24μM ST处理组相比，SV40LT siRNA+24μM ST处理组Rb的蛋白水平和磷酸化水平以及E2F1的蛋白表达水平明显降低（P<0.05）。8SV40LT siRNA干扰对Het-1A细胞G_2期关键调控因子（Cdc2/p-Cdc2和CyclinB1）的影响Western Blot检测结果显示，SV40LT siRNA+DMSO处理组细胞内Cdc2的蛋白水平和磷酸化水平以及CyclinB1的蛋白表达水平与ControlsiRNA+DMSO处理组相比均没有明显差异（P>0.05）。与Control siRNA+24μM ST处理组相比，SV40LT siRNA+24μM ST处理组Cdc2的蛋白水平和磷酸化水平以及CyclinB1的蛋白表达水平明显降低（P<0.05）。综合以上结果表明，敲低Het-1A细胞中的SV40LT抗原会部分逆转ST对Het-1A细胞周期分布及G_1期和G_2期调控蛋白的影响，并且低表达SV40LT抗原的Het-1A细胞被ST处理后，有发生G_1期阻滞的倾向。提示在SV40LT抗原存在的情况下，Het-1A细胞不会发生G_1期阻滞。第叁部分ATM-Chk2和p53-p21信号通路在杂色曲霉素诱导的Het-1A及EPC细胞周期阻滞中的作用目的：探讨杂色曲霉素诱导Het-1A细胞G_2期阻滞和EPC细胞G_1期阻滞的可能分子机制。方法：1采用Western Blot方法观察ST单独处理后ATM-Chk2和p53-p21信号通路相关分子的表达情况。2给予ATM特异性抑制剂KU55933预处理后检测Het-1A细胞中ATM-Chk2信号通路的激活情况以及Het-1A细胞周期的分布情况。3采用FCM和Western Blot方法观察p53siRNA干扰对细胞周期分布及细胞G_2期关键调控因子的影响。结果：1ST处理对EPC细胞ATM-Chk2和p53-p21信号通路的影响Western Blot结果显示，24μM ST处理EPC细胞24h后，ATM和Chk2蛋白的表达水平较溶剂对照组相比无明显差别（P>0.05）。但是，24μM ST处理组ATM和Chk2的磷酸化水平则较溶剂对照组明显升高（P<0.05）。提示ST可以激活EPC细胞中的ATM-Chk2信号通路。Western Blot结果显示，24μM ST处理EPC细胞24h后，p53的磷酸化水平以及p53和p21蛋白的表达水平较溶剂对照组相比明显降低（P<0.05）。提示ST没有激活EPC细胞中的p53-p21信号通路。以上结果提示：ST处理可以激活EPC细胞中的ATM-Chk2信号通路，而p53-p21信号通路没有被激活。2ST对Het-1A细胞ATM-Chk2和p53-p21信号通路的影响Western Blot结果显示，24μM ST处理Het-1A细胞24h后，ATM和Chk2蛋白的表达水平较溶剂对照组相比无明显差别（P>0.05）。但是，24μM ST处理组ATM和Chk2的磷酸化水平则较溶剂对照组明显升高（P<0.05）。提示ST可以激活Het-1A细胞中的ATM-Chk2信号通路。Western Blot结果显示，24μM ST处理Het-1A细胞24h后，p53的磷酸化水平以及p53和p21蛋白的表达水平较溶剂对照组相比明显升高（P<0.05）。提示ST处理可以激活Het-1A细胞中的p53-p21信号通路。以上结果提示：ST处理后Het-1A细胞中的ATM-Chk2和p53-p21信号通路被激活。3KU55933预处理对Het-1A细胞中ATM-Chk2信号通路的影响给予ATM特异性抑制剂KU55933预处理后进一步观察ST对ATM-Chk2信号通路的影响。Western Blot结果显示，KU55933预处理+ST处理组ATM和Chk2的磷酸化水平较ST单独处理组明显下降（P<0.05），表明KU55933可以阻断ST诱导的Het-1A细胞ATM-Chk2信号通路的激活。4KU55933预处理对ST作用后Het-1A细胞周期的影响FCM检测结果显示，与ST单独处理组相比，KU55933预处理+ST处理组细胞周期分布无明显改变（P>0.05）。表明KU55933预处理不影响ST诱导的G_2/M期细胞比例增高，提示ATM-Chk2信号通路的激活并不参与ST诱导Het-1A细胞的G_2期阻滞。5p53siRNA干扰效率的检测p53siRNA以及Control siRNA转染48小时后收集细胞。Real-timePCR和Western blot结果显示：p53siRNA可以显着降低Het-1A细胞p53mRNA和蛋白的表达。上述结果表明，p53siRNA序列可以明显干扰p53在mRNA和蛋白水平的表达。因此，后续的实验中继续选择该siRNA序列进行研究。6p53siRNA干扰对p53-p21信号通路的影响Western Blot检测结果显示，与Control siRNA+24μM ST处理组相比，p53siRNA+24μM ST处理组p53的磷酸化水平以及p53和p21的蛋白表达水平明显降低（P<0.05）。提示p53siRNA干扰可以阻断ST诱导的Het-1A细胞p53-p21信号通路的激活。7p53siRNA干扰对ST作用后Het-1A细胞周期的影响FCM结果显示，与Control siRNA+24μM ST处理组相比，p53siRNA+24μM ST处理组S期细胞比例明显升高（P<0.05），而G_2/M期细胞比例则明显降低（P<0.05）。表明p53siRNA转染可以逆转ST诱导的Het-1A细胞G_2/M期比例增高。提示p53的激活参与了ST诱导的Het-1A细胞G_2期阻滞。8p53siRNA干扰对ST作用后Het-1A细胞G_2期关键调控因子表达变化的影响Western Blot检测结果显示，与Control siRNA+24μM ST处理组相比，p53siRNA+24μM ST处理组Cdc25C、Cdc2和CyclinB1的蛋白表达水平以及Cdc25C和Cdc2磷酸化明显降低（P<0.05）。提示p53siRNA干扰可以逆转ST上调G_2期调控蛋白的作用。综上结果表明，ST处理可以激活Het-1A细胞中ATM-Chk2、p53-p21信号通路，进一步阻断实验表明，ATM-Chk2信号通路的激活并不参与ST诱导的Het-1A细胞周期G_2期阻滞，而p53-p21信号通路的激活参与调控ST诱导的Het-1A细胞G_2期阻滞。结论：1ST可以诱导DNA损伤，导致Het-1A细胞发生G_2期阻滞。2hMLH1可能作为DNA损伤的直接感应因子启动信号级联反应，上调G_2/M期关键调控因子（CyclinB1、Cdc2/p-Cdc2和Cdc25C/p-Cdc25C），进而参与ST诱导的Het-1A细胞G_2期阻滞。3ST可以诱导DNA损伤，导致EPC细胞发生G_1期阻滞。4ST诱导细胞DNA损伤后，EPC细胞发生G_1期阻滞很可能是人食管上皮细胞对ST-DNA损伤的一般应答反应，而Het-1A细胞由于SV40LT抗原的存在缺失G_1期检测点功能而掩盖了人食管上皮细胞的这一应答反应。5ATM-Chk2信号通路的激活，可能参与ST诱导的EPC细胞G_1期阻滞，而不参与ST诱导的Het-1A细胞G_2期阻滞。6p53-p21信号通路的激活可能通过调控G_2期关键调控因子，进而参与ST诱导的Het-1A细胞G_2期阻滞。(本文来源于《河北医科大学》期刊2013-04-01）
杂色曲霉素论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
杂色曲霉素(sterigmatocystin,ST)是一种致癌性真菌毒素,在人类食物中污染非常广泛。我们前期研究发现,ST可诱导人胃黏膜上皮细胞G2期阻滞。普遍认为各种理化因素引发的DNA损伤与细胞周期阻滞和细胞凋亡关系密切。为了进一步探讨ST诱发GES-1细胞G2期阻滞的机制,本实验研究了ST诱导的DNA损伤及损伤下游的ATM/p53信号通路的激活情况。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
杂色曲霉素论文参考文献
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