猪瘟病毒E0、E2基因的原核表达及间接ELISA方法建立

论文摘要

猪瘟（classical swine fever,CSF）是由猪瘟病毒（classical swine fever virus,CSFV）引起的一种急性、烈性、高度接触性传染病。CSFV自19世纪在美国被首次报道以来,对世界养猪业的健康发展造成了严重的影响。猪瘟作为世界卫生组织（OIE）规定的A类疫病,世界上仍主要通过免疫弱毒疫苗的方法来对其进行防控。传统猪瘟弱毒疫苗免疫效力好,给猪群提供了较好的保护。但使用这种类型的疫苗后无法区分感染抗体和疫苗抗体。E2亚单位疫苗是最早投入使用也是当前惟一投入使用的猪瘟标记疫苗。免疫E2亚单位疫苗后不仅能够对抗CSFV野毒株,而且很容易通过检测抗E0蛋白的抗体区分免疫猪和感染猪。在CSFV编码的结构蛋白中,E0和E2糖蛋白均可诱导机体产生中和抗体,同时也是建立CSFV血清学检测方法的主要抗原。因此,在免疫E2亚单位疫苗的基础上,可以利用CSFV的E0和E2基因构建的检测方法,用来分析疫苗免疫效果以及初步区分疫苗抗体和感染抗体,这为进一步开发猪瘟检测试剂盒提供了参考。本实验进行了一系列的研究:（1）根据GeneBank中登录的猪瘟病毒E0和E2基因序列,并参考pET32a载体和蛋白的特点进行特异性引物的设计与合成,并且在引物的上下游5,端分别插入EcoRI和XhoI两种限制性内切酶的酶切位点。E0和E2基因经RT-PCR扩增,得到基因片段分别为699bp和558bp的条带,经克隆测序鉴定后的质粒命名为pMD19T-E0,pMD19T-E2。将pET32a线性载体与克隆质粒中切下的E0和E2基因连接构建重组表达质粒pET32a-E0,pET32a-E2,随后将重组质粒转入宿主菌BL21（DE3）中并进行诱导表达,经SDS-PAGE检测有与预期大小相合的蛋白大量表达,且蛋白主要存在于包涵体中。利用镍柱亲和层析法对pET32a-E0、pET32a-E2蛋白进行纯化,Westernblotting显示pET32a-E0、pET32a-E2蛋白的反应原性较好。（2）利用纯化的pET32a-E0重组蛋白作为抗原,构建了间接ELISA方法。对反应条件的优化结果显示:pET32a-E0重组蛋白的最适抗原包被浓度为0.6μg/mL,包被时间为37℃2 h,4℃过夜;最佳封闭条件为PBST缓冲液稀释的胎牛血清（5%）于37℃恒温反应1 h;血清和酶标抗体的最适稀释度分别为1∶100和1∶20000,两者均于37℃反应1 h;TMB底物显色液于室温暗处反应10 min。基于pET32a-E0蛋白建立的方法重复性试验（批内和批间）显示变异系数小于10%,且与PRRSV、PCV、PRV、PEDV、TGEV阳性血清间不存在抗原交叉反应,具有较高的重复性与特异性。（3）利用纯化的pET32a-E2重组蛋白作为包被抗原进行了间接ELISA方法的建立,对反应条件的优化和选择结果显示pET32a-E2重组蛋白的适宜反应浓度为1.6μg/mL于37℃恒温反应2 h后置于4℃过夜;采用PBST缓冲液溶解的脱脂奶粉（5%）进行封闭效果最好,37℃恒温反应1 h;血清和酶标二抗的最适稀释倍数分别为1∶80和1∶20000,两者均于37℃恒温反应1 h;TMB底物显色液于暗处室温反应15min最佳。所建立的方法重复性试验（批内和批间）显示变异系数小于10%,且与PRRSV、PCV、PRV、PEDV、TGEV阳性血清间不存在抗原交叉反应,具有较高的重复性与特异性。该方法为CSFV抗体的检测提供了一种相对实用的ELISA诊断方法。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 1 引言
•   1.1 CSFV概述
•     1.1.1 CSF的流行病学
•     1.1.2 CSF的临床症状及病理变化
•     1.1.3 CSFV的形态结构及基因组结构
•     1.1.4 CSFV的培养特性
•     1.1.5 CSFV编码的主要蛋白
•   1.2 CSF常用实验室诊断方法
•     1.2.1 RT-PCR检测
•     1.2.2 实时荧光定量PCR检测
•     1.2.3 免疫胶体金检测
•     1.2.4 ELISA方法检测
•     1.2.5 LAMP检测
•   1.3 CSFV疫苗研究进展
•     1.3.1 弱毒疫苗
•     1.3.2 亚单位疫苗
•     1.3.3 核酸疫苗
•     1.3.4 合成肽疫苗
•     1.3.5 活载体疫苗
•   1.4 研究目的与意义
• 2 材料与方法
•   2.1 材料
•     2.1.1 病料与血清
•     2.1.2 主要仪器
•     2.1.3 试验所用溶液
•     2.1.4 其他相关试验材料
•   2.2 方法
•     2.2.1 CSFV E0、E2 基因的克隆扩增及重组表达质粒的构建
•     2.2.2 重组表达质粒pET32a-E0、pET32a-E2 的表达、鉴定与纯化
•     2.2.3 pET32a-E0、pET32a-E2 重组蛋白间接ELISA检测方法的建立
• 3 结果
•   3.1 CSFV E0、E2 基因的扩增及鉴定
•   3.2 CSFV E0、E2 基因的原核表达
•     3.2.1 重组表达质粒pET32a-E0、pET32a-E2 的鉴定及表达
•     3.2.2 重组p ET32a-E0、p ET32a-E2 蛋白的可溶性鉴定
•     3.2.3 pET32a-E0、pET32a-E2 蛋白的纯化及反应原性鉴定
•   3.3 重组pET32a-E0、pET32a-E2 蛋白间接ELISA方法建立
•     3.3.1 重组pET32a-E0、pET32a-E2 蛋白及阴阳性血清最佳稀释浓度
•     3.3.2 最适封闭液确定
•     3.3.3 最佳包被时间确定
•     3.3.4 最佳酶标二抗稀释倍数
•     3.3.5 底物最佳显色时间
•     3.3.6 阴阳性临界值的确定
•     3.3.7 特异性试验
•     3.3.8 重复性试验
•     3.3.9 临床样品的检测
• 4 讨论
•   4.1 CSFV E2和E0 基因的克隆及原核表达
•   4.2 重组pET32a-E0和pET32a-E2蛋白间接ELISA检测方法的建立
• 5 结论
• 参考文献
• 附录
• 作者简介
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 高佩佩

导师: 范京惠

关键词: 猪瘟病毒,蛋白,诊断方法

来源: 河北农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 河北农业大学

分类号: S852.651

总页数: 59

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