泡盛曲霉β-1,3-1,4-葡聚糖酶AaBglu12A的表达、酶学性质及应用

论文摘要

β-1,3-1,4-葡聚糖酶是食品、饲料等轻工业行业中重要的糖苷水解酶之一,其广泛应用于啤酒糖化、寡糖制备等过程,并且也是常用的饲料添加剂。由于具有重要应用价值,目前针对β-1,3-1,4-葡聚糖酶开发的研究越来越受到重视。因此,基于前期研究结果,本研究对泡盛曲霉CAU33中的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因AaBglu12A进行了表达、性质和应用研究,获得以下主要结论:1.从泡盛曲霉CAU33克隆获得β-1,3-1,4葡聚糖酶基因AaBglu12A,该基因编码239个氨基酸,编码区含有两个内含子,长度分别为48 bp和66 bp;预测AaBglu12A编码的成熟蛋白分子量为24.17 kDa,等电点为4.63;通过氨基酸序列比对推测AaBglu12A为新型GH 12家族β-1,3-1,4-葡聚糖酶;在毕赤酵母表达系统中成功表达AaBglu12A,通过高拷贝筛选获得具有高β-1,3-1,4-葡聚糖酶产酶活性的克隆,并且在5-L发酵罐中进行高密度发酵,其发酵上清液酶活力达到159500 U/mL,蛋白质含量达到31.7 mg/mL,菌体湿重达到404 g/L,达到了较高的β-1,3-1,4-葡聚糖酶发酵水平。2.将发酵获得的β-1,3-1,4-葡聚糖酶AaBglu12A的粗酶液经过Q-Sepharose FF阴离子交换柱一步纯化得到了电泳级纯酶,其比酶活达到7049 U/mg;SDSPAGE凝胶电泳法和凝胶过滤色谱法所测定的AaBglu12A的分子量分别为23.6kDa和23.2 kDa,表明AaBglu12A为单亚基蛋白;酶学性质结果表明AaBglu12A的最适pH为5.0,在pH 2.0-9.0之间保持稳定;AaBglu12A的最适温度为55°C,在60°C以下保持稳定;AaBglu12A对β-1,3-1,4-葡聚糖具有严格底物特异性,其对大麦和燕麦β-葡聚糖的水解产物主要为三糖和四糖,对地衣多糖的水解产物为以三糖为主的DP 2-4的葡寡糖。3.将纯化获得的AaBglu12A应用于啤酒糖化工艺,当加入70 U/g麦芽的AaBglu12A时,麦芽汁粘度降低9.61%,过滤时间缩短34.5%,该结果优于大部分目前所报道的β-1,3-1,4-葡聚糖酶,表明AaBglu12A在啤酒酿造过程具有良好的工业应用价值;在从燕麦麸皮制备葡寡糖的应用研究中,通过单因素实验优化了AaBglu12A葡寡糖的酶解制备条件,当固液比为1:20、酶解温度为50°C、酶解加酶量为100 U/g燕麦麸皮、酶解时间4h时,葡寡糖得率最高,达到90%,表明AaBglu12A在葡寡糖的制备方面具有优良的工业应用潜力。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 第1章 文献综述
•   1.1 β-葡聚糖
•   1.2 β-葡聚糖酶
•   1.3 β-1,3-1,4-葡聚糖酶
•     1.3.1 β-1,3-1,4-葡聚糖酶的来源
•     1.3.2 β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶学性质
•     1.3.3 β-1,3-1,4-葡聚糖酶的异源表达
•   1.4 β-1,3-1,4-葡聚糖酶的应用
•     1.4.1 β-1,3-1,4-葡聚糖酶在啤酒酿造中的应用
•     1.4.2 β-1,3-1,4-葡聚糖酶在葡寡糖制备中的应用
•     1.4.3 β-1,3-1,4-葡聚糖酶在饲料工业中的应用
•   1.5 本课题的立题意义与目的
• 第2章 泡盛曲霉β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因AaBglu12A的表达
•   2.1 试验材料与仪器
•     2.1.1 菌株及载体
•     2.1.2 主要试验材料
•     2.1.3 培养基
•     2.1.4 主要试验仪器
•   2.2 试验方法
•     2.2.1 泡盛曲霉CAU33 基因组DNA的提取
•     2.2.2 泡盛曲霉CAU33总RNA的提取
•     2.2.3 cDNA第一链的合成
•     2.2.4 β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因AaBglu12A的 PCR扩增与序列分析
•     2.2.5 β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因AaBglu12A与表达载体的构建
•     2.2.6 β-1,3-1,4 葡聚糖酶基因AaBglu12A的异源表达及转化子筛选
•     2.2.7 高拷贝转化子筛选
•     2.2.8 重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶AaBglu12A在毕赤酵母中的高密度发酵
•     2.2.9 β-1,3-1,4 葡聚糖酶AaBglu12A的酶活力测定
•     2.2.10 β-1,3-1,4 葡聚糖酶AaBglu12A的蛋白质含量测定
•     2.2.11 β-1,3-1,4 葡聚糖酶AaBglu12A的 SDS-PAGE分析
•   2.3 结果与分析
•     2.3.1 β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因AaBglu12A的 PCR扩增与序列分析
•     2.3.2 β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因AaBglu12A在毕赤酵母中的表达
•     2.3.3 重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶AaBglu12A在毕赤酵母中的高密度发酵
•   2.4 本章小结
• 第3章 泡盛曲霉β-1,3-1,4-葡聚糖酶AaBglu12A的酶学性质研究..
•   3.1 试验材料与仪器
•     3.1.1 主要试验材料
•     3.1.2 主要试验仪器
•   3.2 试验方法
•     3.2.1 β-1,3-1,4 葡聚糖酶AaBglu12A的纯化
•     3.2.2 β-1,3-1,4 葡聚糖酶AaBglu12A的酶活力测定
•     3.2.3 β-1,3-1,4 葡聚糖酶AaBglu12A的蛋白质含量测定
•     3.2.4 β-1,3-1,4 葡聚糖酶AaBglu12A的 SDS-PAGE分析
•     3.2.5 β-1,3-1,4 葡聚糖酶AaBglu12A的分子量测定
•     3.2.6 β-1,3-1,4-葡聚糖酶AaBglu12A的最适pH和 pH稳定性
•     3.2.7 β-1,3-1,4-葡聚糖酶AaBglu12A的最适温度,温度稳定性和半衰期
•     3.2.8 β-1,3-1,4-葡聚糖酶AaBglu12A的底物特异性
•     3.2.9 β-1,3-1,4-葡聚糖酶AaBglu12A的水解特性
•     3.2.10 金属离子及化合物对β-1,3-1,4-葡聚糖酶AaBglu12A活力的影响
•   3.3 结果与分析
•     3.3.1 β-1,3-1,4-葡聚糖酶AaBglu12A的纯化
•     3.3.2 β-1,3-1,4-葡聚糖酶AaBglu12A的分子量测定
•     3.3.3 β-1,3-1,4-葡聚糖酶AaBglu12A的酶学性质
•     3.3.4 β-1,3-1,4-葡聚糖酶AaBglu12A的底物特异性
•     3.3.5 β-1,3-1,4-葡聚糖酶AaBglu12A的水解特性
•     3.3.6 金属离子及化合物对β-1,3-1,4-葡聚糖酶AaBglu12A酶活力的影响
•   3.4 本章小结
• 第4章 泡盛曲霉β-1,3-1,4-葡聚糖酶AaBglu12A的应用研究
•   4.1 试验材料与仪器
•     4.1.1 主要试验材料
•     4.1.2 主要试验仪器
•   4.2 试验方法
•     4.2.1 β-1,3-1,4-葡聚糖酶AaBglu12A在麦芽糖化中的应用
•     4.2.2 β-1,3-1,4-葡聚糖酶AaBglu12A酶解燕麦麸皮制备葡寡糖的应用
•   4.3 结果与分析
•     4.3.1 β-1,3-1,4-葡聚糖酶AaBglu12A在麦芽糖化中的应用
•     4.3.2 β-1,3-1,4-葡聚糖酶AaBglu12A酶解燕麦麸皮制备葡寡糖的应用
•   4.4 本章小结
• 第5章 结论与展望
•   5.1 结论
•   5.2 论文创新点
•   5.3 展望
• 参考文献
• 缩略语词汇表
• 致谢
• 攻读学位期间的研究成果

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 陈子贤

导师: 江正强,朱文学

关键词: 葡聚糖酶,泡盛曲霉,基因克隆,性质,应用

来源: 河南科技大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,一般化学工业

单位: 河南科技大学

基金: 国家自然科学基金项目(31471688)

分类号: Q936;TQ925

总页数: 68

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