NLRX1和Sam68调控丙型肝炎病毒复制机制研究

论文摘要

丙型肝炎病毒（HCV）是一种重要的人类病原体,全世界有超过1.7亿人被感染,它可导致慢性肝炎、肝硬化、甚至肝癌。目前还没有有效针对丙型肝炎病毒的疫苗。HCV是一种单股正链RNA病毒,编码产生3种结构蛋白和7种非结构蛋白。HCV感染人类细胞后,受到宿主先天免疫应答的调控。病毒入侵宿主细胞后,模式识别受体RIG-I样受体识别病毒的病原相关分子模式（PAMPs）,RIG-I和MDA5被激活后发生构象变化,激活定位在线粒体外膜上的接头蛋白MAVS,MAVS招募并激活IRF3和NF-kB,最终诱导I型、III型干扰素以及其他抗病毒细胞因子的产生。我们的研究发现,HCV上调肝细胞内的NLRX1蛋白水平。沉默NLRX1可抑制HCV复制,而过表达NLRX1则促进HCV复制和病毒蛋白的积累。在稳定沉默NLRX1的细胞系中感染HCV,I型干扰素、III型干扰素和干扰素诱导基因（ISGs）的mRNA水平都明显上升。进一步研究发现,NLRX1与接头蛋白MAVS结合,诱导MAVS泛素化降解。深入研究发现,NLRX1与PCBP2相互作用,并促进MAVS的K48位泛素化。除了HCV之外,NLRX1对其它RNA病毒诱导的先天性免疫反应也起负调控作用。另外我们发现HCV感染诱使Sam68从细胞核转移到细胞质,Sam68结合于病毒基因组5’-UTR的第2个茎环结构,促进病毒复制。综上所述,NLRX1通过招募PCBP2促进关键信号分子MAVS的泛素化降解,从而抑制HCV诱导的人肝细胞先天免疫应答,最终导致导致HCV持续感染。Sam68直接靶向HCV基因组RNA,促进HCV在宿主细胞中复制。本研究工作寻找到了两个关键的宿主蛋白NLRX1和Sam68分别通过调控先天免疫信号通路和直接靶向HCV基因组RNA的方式,调控HCV在宿主细胞内的复制,本研究为在丙型肝炎病毒感染过程中宿主对病毒的调控机理的理解提供了新见解,也为开发潜在丙型肝炎病毒的疫苗提供了新思路。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩写
• 第1章 绪论
•   1.1 先天免疫应答概述
•     1.1.1 TLR受体
•     1.1.2 TLR信号传导通路
•     1.1.3 RLR受体
•     1.1.4 RLR信号传导通路
•     1.1.5 其他受体
•     1.1.6 HCV相关先天免疫反应
•   1.2 先天免疫调控因子
•     1.2.1 泛素化修饰
•     1.2.2 宿主蛋白对先天免疫的调控
•     1.2.3 病毒对先天免疫应答的调控
•   1.3 NLRX1 蛋白
•   1.4 PCBP2 蛋白
•   1.5 丙型肝炎病毒
•     1.5.1 丙型肝炎病毒简介
•     1.5.2 丙型肝炎病毒结构
•     1.5.3 丙型肝炎病毒研究进展
•   1.6 Sam68 蛋白
•   1.7 本课题设计思路
• 第2章 NLRX1 抑制HCV诱导的先天免疫应答
•   2.1 前言
•   2.2 实验材料
•     2.2.1 材料与试剂
•     2.2.2 仪器设备
•   2.3 实验方法
•     2.3.1 质粒构建
•     2.3.2 质粒的转染
•     2.3.3 细胞内总RNA的提取
•     2.3.4 逆转录PCR
•     2.3.5 实时定量PCR（SYBR Green）
•     2.3.6 细胞培养
•     2.3.7 细胞总蛋白的提取
•     2.3.8 蛋白免疫印迹（Western Blot）
•     2.3.9 免疫荧光试验
•   2.4 结果与讨论
•     2.4.1 HCV诱导NLRX1 表达
•     2.4.2 NLRX1 促进HCV复制
•     2.4.3 NLRX1 抑制HCV诱导的先天免疫应答
•     2.4.4 NLRX1 抑制RNA病毒诱导的先天免疫应答
•   2.5 小结
• 第3章 NLRX1 促进MAVS发生K48 位依赖的泛素化降解
•   3.1 前言
•   3.2 实验材料
•     3.2.1 材料与试剂
•     3.2.2 仪器设备
•   3.3 实验方法
•     3.3.1 蛋白质免疫共沉淀
•     3.3.2 免疫印迹实验步骤
•   3.4 结果与讨论
•     3.4.1 HCV促进NLRX1与MAVS相互作用
•     3.4.2 NLRX1 促进MAVS降解依赖于蛋白酶体途径
•     3.4.3 NLRX1 促进MAVS发生K48 依赖的多聚泛素化降解
•   3.5 小结
• 第4章 NLRX1 利用PCBP2 降解MAVS
•   4.1 前言
•   4.2 实验材料
•     4.2.1 材料与试剂
•     4.2.2 仪器设备
•   4.3 实验方法
•     4.3.1 质粒构建
•     4.3.2 免疫印迹实验步骤
•     4.3.3 免疫共沉淀实验步骤
•     4.3.4 实时定量PCR（SYBR Green）
•   4.4 结果与讨论
•     4.4.1 NLRX1与PCBP2 相互作用
•     4.4.2 PCBP2 促进NLRX1 介导的MAVS泛素化降解
•     4.4.3 HCV促进PCBP2 降解MAVS
•   4.5 小结
• 第5章 NLRX1 利用PCBP2 抑制HCV诱导的先天免疫应答
•   5.1 前言
•   5.2 实验材料
•     5.2.1 材料与试剂
•     5.2.2 仪器设备
•   5.3 实验方法
•     5.3.1 实时定量PCR（SYBR Green）
•   5.4 结果与讨论
•     5.4.1 PCBP2 抑制HCV诱导的先天免疫应答
•     5.4.2 NLRX1与PCBP2 互助负调控HCV诱导的免疫印应答
•   5.5 小结
• 第6章 Sam68 促进HCV复制
•   6.1 前言
•   6.2 实验材料
•     6.2.1 材料与试剂
•     6.2.2 仪器设备
•   6.3 实验方法
•     6.3.1 质粒构建
•     6.3.2 免疫印迹实验
•     6.3.3 免疫共沉淀实验步骤
•     6.3.4 实时定量PCR（SYBR Green）
•     6.3.5 免疫荧光实验
•     6.3.6 双荧光素酶报告基因实验
•     6.3.7 体外转录（Ambion）
•     6.3.8 电穿孔法转染RNA
•     6.3.9 细胞质与细胞核分离实验
•   6.4 结果与讨论
•     6.4.1 Sam68 升高HCV蛋白水平
•     6.4.2 Sam68 促进HCV复制
•     6.4.3 HCV诱导Sam68 由细胞核移位至细胞质
•   6.5 小结
• 第7章 Sam68 结合于HCV的5’非编码区第2 个茎环结构
•   7.1 前言
•   7.2 实验材料
•     7.2.1 材料与试剂
•   7.3 实验方法
•     7.3.1 质粒构建
•     7.3.2 免疫印迹实验
•     7.3.3 实时定量PCR（SYBR Green）
•     7.3.4 RNA免疫共沉淀实验
•     7.3.5 蛋白质原核表达纯化
•   7.4 结果与讨论
•     7.4.1 Sam68 直接结合HCV基因组RNA
•     7.4.2 Sam68 结合于HCV5'-UTR
•     7.4.3 Sam68 结合HCV5′-UTR茎环结构2（SL2）
•     7.4.4 Sam68的1至157 氨基酸结合于HCV基因组并促进病毒复制
•   7.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录 攻读学位期间所发表的学术论文目录
• 致谢

文章来源

类型: 博士论文

作者: 覃煜雯

导师: 朱海珍

关键词: 先天免疫应答,复制

来源: 湖南大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 湖南大学

分类号: R373.21

DOI: 10.27135/d.cnki.ghudu.2019.001525

总页数: 115

文件大小: 3483K

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