人LDHA基因真核表达载体的构建及其功能鉴定

论文摘要

目的构建带有绿色荧光蛋白（GFP）标签的人乳酸脱氢酶A（LDHA）的真核表达载体,并对其生物学功能进行初步研究。方法利用PCR技术从人乳腺文库中扩增出人LDHA基因,并将其克隆到pEGFP-C1载体上,经双酶切和测序鉴定成功后转染到肝癌HepG2细胞中,通过Western印迹检测其表达情况,免疫荧光检测其亚细胞定位,并利用生长曲线、克隆形成以及划痕实验探究LDHA对肝癌HepG2细胞增殖、迁移能力的影响。结果从人乳腺文库中扩增获得大小约为1000 bp的DNA片段,并成功克隆至pEGFP-C1载体上,经测序与目的序列完全一致;转染肝癌HepG2细胞后目的基因成功表达;荧光显微镜观察发现,GFP-LDHA融合蛋白主要聚集于细胞质中;细胞生长曲线和克隆形成实验结果显示,转染pEGFP-LDHA的肝癌细胞较空载体细胞增殖能力增强;划痕实验显示,转染pEGFP-LDHA的肝癌细胞较空载体细胞迁移性增强。结论成功构建了带GFP标签的人LDHA真核表达载体,为进一步研究LDHA在肝癌细胞中的功能奠定了基础。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1 材料
•   1.2 方法
•     1.2.1 pEGFP‐LDHA重组质粒的构建与测序鉴定
•     1.2.2 转染肝癌HepG2细胞系和蛋白质免疫印迹检测
•     1.2.3 免疫荧光实验
•     1.2.4 生长曲线实验
•     1.2.5克隆形成实验
•     1.2.6 划痕实验
•   1.3 统计学处理
• 2结果
•   2.1 pEGFP‐LDHA重组质粒的构建与鉴定
•   2.2 Western印迹检测GFP‐LDHA融合蛋白在HepG2细胞中的表达
•   2.3免疫荧光检测GFP‐LDHA融合蛋白主要定位于HepG2细胞质中
•   2.4 CCK8法验证GFP‐LDHA融合蛋白促进HepG2细胞的生长
•   2.5克隆形成实验验证GFP‐LDHA融合蛋白促进HepG2细胞的增殖
•   2.6划痕实验验证GFP‐LDHA融合蛋白促进HepG2细胞的迁移
• 3讨论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 张德宇,马路园,朱祥,刘娟,杨旭辉,陈玉,徐小洁,叶棋浓

关键词: 人基因,克隆,真核表达,肝癌细胞株,聚合酶链反应,绿色荧光蛋白质类

来源: 军事医学 2019年06期

年度: 2019

分类: 医药卫生科技,基础科学

专业: 生物学,肿瘤学

单位: 军事科学院军事医学研究院生物工程研究所细胞工程研究室,首都医科大学宣武医院呼吸科

基金: 国家自然科学基金（81822037,81672589）

分类号: Q78;R735.7

页码: 406-410

总页数: 5

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