逆行嗜神经工具病毒的改造与应用

论文摘要

嗜神经工具病毒是神经科学领域最为重要的研究工具之一,在神经网络的结构和功能解析中应用广泛。狂犬病毒（rabies virus,RV）是常用的逆行嗜神经工具病毒,用于标记特定脑区神经元的输入网络。单纯疱疹病毒1型（herpes simplex virus type 1）H129株（HSV1 H129）是常用的顺向跨多级突触示踪神经环路的工具病毒,可以标记目标脑区神经元的多级输出网络。但也有报道H129并非严格的顺向跨突触传播,也存在轴突末梢吸收并逆行感染的问题。本文围绕RV和HSV示踪病毒的逆向传播特性,主要进行了两方面的工作。首先,基于具有逆向标记特性的G蛋白缺失重组RV,构建了携带表达胞体定位光敏感蛋白ChR2的重组RV病毒。其次,本文研究发现了HSV具有逆标后继续顺向跨突触传播的性质,表明现有HSV顺行跨多级示踪病毒可能存在非特异标记问题,并探讨了如何利用该性质进行相关的标记实验。（1）光遗传学技术在神经环路功能研究中应用广泛。但是利用表达光敏感蛋白channelrhodopsin-2（ChR2）的RV载体进行研究时,由于ChR2弥散性表达于神经元所有结构,在光刺激目标脑区时,非目标脑区神经元在目标脑区的过路神经纤维也有可能被非特异激活。为了降低这种非特异性激活,本文将钾离子通道Kv2.1的胞体定位信号肽基因序列与ChR2基因序列融合插入于重组RV感染性质粒载体特定位点,制备了一种表达胞体定位ChR2（soma-targeted channelrhodopsin,stChR2）的重组RV载体。由于ChR2被限制表达于神经元胞体及轴突与树突的近胞体端,可以有效地避免过路神经纤维的非特异性刺激。（2）已有报道H129存在轴突末梢吸收、逆行感染的问题,但H129轴突吸收后能否以侧枝神经元为基础再次顺向传播仍然未知。本文中我们利用Cre重组酶依赖复制跨突触及表达荧光报告基因的H129工具病毒（H129△TK-TT）和补偿表达Cre的rAAV辅助病毒,在小鼠中枢神经系统进行了相关标记实验。结果表明H129存在明显的轴突末梢吸收感染,而且能够通过逆标的上游神经元起始顺向跨突触传播并标记下游神经网络,从而混杂在H129顺行跨突触标记的神经网络中,干扰示踪结果的准确翻译,因此需研发更严谨型的H129工具病毒系统。最后,本文讨论了如何利用该性质进行标记具有特定投射神经元的输出网络。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
•   1.1 嗜神经工具病毒在神经环路研究中的意义
•   1.2 具有逆行标记特性的嗜神经工具病毒
•     1.2.1 狂犬病毒
•     1.2.2 单纯疱疹病毒
•     1.2.3 逆行标记的腺相关病毒
•     1.2.4 伪狂犬病毒
•   1.3 腺相关病毒辅助病毒
•   1.4 本文主要研究内容
• 第二章 一种用于精确操控神经环路的携带胞体定位ChR2重组RV
•   2.1 研究背景
•   2.2 实验材料与步骤
•     2.2.1 实验试剂和耗材
•     2.2.2 病毒的包装
•     2.2.3 实验动物及脑立体定位注射
•   2.3 实验结果
•     2.3.1 病毒的拯救
•     2.3.2 活体标记验证病毒的表达与分布
•     2.3.3 利用SAD-RV-N2C（G）-stChR2-EYFP进行功能实验
•   2.4 讨论
•     2.4.1 stChR2比ChR2具有更低的光毒性并降低非特异性激活
•     2.4.2 RV载体比AAV载体具有多种优势
• 第三章 HSV顺行示踪病毒轴突末梢感染及后续跨突触传播
•   3.1 研究背景
•   3.2 实验材料及步骤
•     3.2.1 实验常用仪器、溶液及耗材等
•     3.2.2 实验动物及脑立体定位注射
•   3.3 实验结果
•     3.3.1 H129△TK-TT工作原理及实验策略
•     3.3.2 H129△TK-TT感染表达特性验证
•     3.3.3 H129△TK-TT的轴突末梢感染
•     3.3.4 H129△TK-TT轴突吸收逆行感染后复制及顺向跨突触传播
•   3.4 讨论
•     3.4.1 HSV1 H129轴突吸收逆行感染后能够复制及顺向跨突触传播
•     3.4.2 HSV工具病毒标记具有特定投射神经元的输出网络
• 第四章 总结与展望
• 参考文献
• 附录 部分脑区缩写及中英文全称
• 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 钟鑫

导师: 徐富强

关键词: 逆行嗜神经工具病毒,狂犬病毒,单纯疱疹病毒型株,逆标后顺行跨突触传播

来源: 中国科学院大学(中国科学院武汉物理与数学研究所)

年度: 2019

分类: 基础科学,信息科技

专业: 生物学,自动化技术

单位: 中国科学院大学(中国科学院武汉物理与数学研究所)

分类号: TP183;Q78

总页数: 73

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