导读:本文包含了限制性内切酶介导整合论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:葡萄溃疡病菌,原生质体制备,REMI
限制性内切酶介导整合论文文献综述
张鑫,刘爱芬,张玮,严红,乔广行[1]（2013）在《葡萄溃疡病菌限制性内切酶介导整合方法的建立及转化子库的构建》一文中研究指出【目的】摸索葡萄溃疡病菌(Lasiodiplodia theobromae)限制性内切酶介导整合(Restriction enzyme mediated integration,REMI)的转化方法,并构建CSS-01s(L.theobro-mae)的REMI转化子库。【方法】利用REMI转化方法,将线性化的含有潮霉素抗性基因(Hygromycin phosphotransferase gene,Hyg)的pUCATPH质粒转化CSS-01s菌株的原生质体;测定其对潮霉素B的敏感浓度,摸索不同酶解液和酶解时间对原生质体制备的影响,统计不同限制性内切酶酶量对转化效率的影响,以摸索出的最优条件构建CSS-01s菌株的REMI转化子库,采用Southern blot的方法验证转化子。【结果】首次建立了一套L.theobromae的REMI转化方法,经转化得到包含6 000余个转化子的L.theobromae CSS-01s转化子库,随机挑选的5个转化子经Southern blot分析,质粒均插入到了HindⅢ相应的酶切位点处。【结论】浓度为2%崩溃酶+2%蜗牛酶酶混合液、酶解4 h为原生质体获得的最优条件,每管转化体系中加入30 U HindⅢ时转化效率最高,该方法可以用来获得大量不同表型的REMI转化子。(本文来源于《微生物学通报》期刊2013年07期）
朱凯[2]（2010）在《限制性内切酶介导整合法筛选禾长蠕孢菌Ophiobolin A合成缺陷型突变体》一文中研究指出禾长蠕孢菌(Helminthosporium gramineum Rabenh f. sp. echinochloae,简称为HGE)是本课题组于一株感病的稗草上分离得到的杂草生防潜力菌,经研究发现对稗草等稻田常见杂草有较强的致病作用并对水稻等作物安全。同时,该菌可以产生以ophiobolin A为主的多种ophiobolin族毒素对稗草等稻田常见杂草起致病作用,因而具有开发成优良的生物源除草剂的潜力。限制性内切酶介导整合法(Restriction Enzyme Mediated Integration,简称REMI法)最早是在Saccharomyces cerevisiae的转化体系中建立起来的,现已成功地运用到丝状真菌的转化与基因标记中。本论文通过REMI法对禾长蠕孢菌HGE原生质体进行转化,拟通过外源质粒pSH75插入到HGE菌基因组中的随机性来获得ophiobolin A合成缺陷型突变株,进而克隆到一个或多个控制毒素合成的功能基因,确定其代谢途径,最终通过基因调控的方法获得大量表达的有效毒素,为培育高效工程菌提供基因资源。研究内容及结果如下:HGE菌原生质体的制备与再生条件研究。由于禾长蠕孢菌为丝状真菌,具有成分复杂的细胞壁结构,能够阻止外源质粒与限制性内切酶进入细胞。所以,建立合适的原生质体制备条件是转化成功的首要工作。同时,原生质体的再生情况直接关系到禾长蠕孢菌的转化率。因而,原生质体制备和再生技术是禾长蠕孢菌转化与基因克隆技术的基础。试验结果表明,禾长蠕孢菌液体培养菌丝体原生质体释放最佳的酶解体系及条件为:0.4mol/L MgSO4溶液作为稳渗剂及酶解缓冲液,0.5%崩溃酶+0.5%裂解酶+0.5%蜗牛酶于26℃条件下酶解菌龄为6h的菌丝体2h;同时,原生质体再生率最高时对应的酶解体系及条件为:32℃条件下,用0.7mol/L NaCl溶液配制的0.5%崩溃酶酶解培养时间为16h的菌丝体4h。从以上的单因素试验结果可知,禾长蠕孢菌菌丝体最佳原生质体制备与再生酶解条件差别较大,综合考虑原生质体制备与再生对于后续实验的影响,选择原生质体再生率最高时对应的酶解体系及条件为最适条件。禾长蠕孢菌原生质体转化及突变体筛选与验证。通过利用质粒pSH75对HGE菌原生质体进行转化后得到了大量的转化子,经过初步的筛选后,摒弃了流产转化子及生长速度不能满足后续试验要求的突变体。采用发酵液抑制水稻纹枯病菌试验、稗草温室生测及HPLC检测毒素含量等实验后初步认定,转化子B014为ophiobolin A毒素合成缺陷型突变体,为本项试验的目的转化子。同时,对多株突变体基因组DNA进行PCR检测后,均得到了目的条带,充分说明了质粒pSH75已经成功插入到转化子的基因组中。Southern blot检测表明pSH75是单拷贝插入转化子B014中,为后续基因克隆奠定基础。另外,在论文研究规定内容之外,研究了禾长蠕孢菌野生型发酵液及粗毒素对水稻细菌性条斑病菌的抑制情况。结果发现,HGE发酵液和粗毒素的MIC(最低抑菌浓度)和MBC(最低杀菌浓度)均低于20%噻菌铜SC、72%农用链霉素SP和20%叶枯唑SP。说明HGE粗毒素具有开发成微生物农药的潜力。(本文来源于《中国农业科学院》期刊2010-06-01）
郝小丽,韦建福,魏士平,姚元红[3]（2008）在《限制性内切酶介导整合技术在真菌功能基因研究中的应用》一文中研究指出限制性内切酶介导整合(REMI)技术是一种在限制性内切酶存在的条件下,将线性化的质粒DNA随机插入到真菌基因组DNA中,从而产生插人突变的技术。本文综述介绍了限制性内切酶介导的整合技术的一些基本情况,包括REMI的步骤、技术原理、应用范围、应用概况、技术优点和存在问题等。(本文来源于《中国植病、菌物学会杭州联合年会论文集》期刊2008-10-01）
李铁民,孟晋[4]（2005）在《限制性内切酶介导的整合技术》一文中研究指出限制性内切酶介导的整合技术是近年发展起来的一种研究基因的新方法,与质粒拯救相结合,可快速分离质粒两侧的DNA序列,进而对该序列做进一步分析和研究.该技术已应用于基因突变、基因标记、寻找新基因等研究领域.本文重点介绍了限制性内切酶介导的整合技术的原理、影响因素及应用现状.(本文来源于《辽宁大学学报(自然科学版)》期刊2005年04期）
伏建国,强胜,朱云枝[5]（2005）在《链格孢菌原生质体的制备与限制性内切酶介导整合(REMI)转化的致病性诱变》一文中研究指出以链格孢菌Alternariaalternata菌株NEW为供试菌株,研究了菌龄、酶系统、酶解时间、酶解温度及稳渗剂对链格孢菌原生质体制备的影响。结果表明,制备链格孢菌原生质体比较适宜的条件为PD液体培养基培养20h,以0.7mol/LNaCl为稳渗剂、1%LysingEnzyme、1%Drislase和1%Snailase3种酶溶液混合使用,30℃酶解3h。对原生质体进行了限制性内切酶介导整合(REMI)转化,筛选到了链格孢菌弱致病突变株NEW001,为致病相关基因的标记和克隆打下了基础。(本文来源于《菌物学报》期刊2005年03期）
伏建国[6]（2005）在《链格孢菌强产毒菌株的筛选和限制性内切酶介导整合（REMI）转化的产毒诱变》一文中研究指出分离自紫茎泽兰的链格孢菌产生的真菌毒素具有开发生物源除草剂的潜力。菌株产毒能力大小直接影响到发酵产物的毒素含量和杀草效果，强产毒能力菌株的筛选对于产业化十分必要。本文通过链格孢菌不同菌株间与产毒相关的生物学特性进行比较研究，目的是筛选强产毒菌株。进一步，进行链格孢菌原生质体制备试验，探索最适合的体系和条件，之后，进行限制性内切酶介导整合(REMI)原生质体转化试验，摸索REMI转化的方法和条件，目的是获得产毒减弱REMI突变株，为产毒相关基因的克隆提供研究材料。分离自不同地区的链格孢菌菌株的产毒量不同，在继代培养的过程中也会发生产毒突变。通过液体培养产毒实验，从现有的21个链格孢菌菌株中筛选出产毒最强的菌株NEW。并对这21个链格孢菌菌株的部分生物学特性进行了比较研究，通过SAS统计软件分析了各生物学特性间的相关性。发现链格孢菌的致病力、产毒量和产孢量呈显着正相关。利用这一相关性，可以通过筛选致病力增强突变株来筛选强产毒突变株。紫外诱变是微生物育种最常用的方法之一。通过紫外照射对链格孢菌的产毒特性进行了诱变，获得了紫外照射时间对链格孢菌分生孢子的致死曲线，但最后并没有筛选到产毒增强的突变体。还需进一步的筛选或找出提高菌株产毒量的替代途径。以筛选出的产毒量最大的菌株NEW为供试菌株，研究了菌龄、酶系统、酶解时间、酶解温度及稳渗剂对链格孢菌原生质体制备的影响，探索出了适合链格孢菌菌原生质体制备的体系和条件：菌丝块在PD液体培养基中培养20h后收集菌丝体，以0.7 mol／L NaCl为稳渗剂，1％Lysing Enzyme、1％Drislase和1％Snailase3种酶溶液混合使用，30℃酶解3h。利用该方法获得的原生质体数量和再生率都符合转化的要求。对REMI的转化体系进行了摸索，确定了限制性内切酶的用量，质粒的形式及用量，成功地获得了链格孢菌的REMI转化子。从获得的转化子中筛选出四个致病力减弱突变株NEW001、NEW021、NEW061和NEW073。通过HPLC检测发现四个突变株的产毒量都有所下降，其中突变株NEW001的产毒量不足野生型菌株NEW的五十分之一，是克隆产毒相关基因的很好突变材料。对四个产毒减弱突变株致病力、产毒量、产孢量、孢子形态、菌落生长速率等生物学特性与野生菌株NEW进行了比较分析，相关性分析再次验证了产毒量、产孢量与致病力之间的正相关关系，为致病机理的研究提供了思路。PCR扩增验证了质粒pSH75插入了病原菌基因组中，获得的四个突变体，尤其是NEW001可用于下一步的基因克隆工作。(本文来源于《南京农业大学》期刊2005-07-01）
限制性内切酶介导整合论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
禾长蠕孢菌(Helminthosporium gramineum Rabenh f. sp. echinochloae,简称为HGE)是本课题组于一株感病的稗草上分离得到的杂草生防潜力菌,经研究发现对稗草等稻田常见杂草有较强的致病作用并对水稻等作物安全。同时,该菌可以产生以ophiobolin A为主的多种ophiobolin族毒素对稗草等稻田常见杂草起致病作用,因而具有开发成优良的生物源除草剂的潜力。限制性内切酶介导整合法(Restriction Enzyme Mediated Integration,简称REMI法)最早是在Saccharomyces cerevisiae的转化体系中建立起来的,现已成功地运用到丝状真菌的转化与基因标记中。本论文通过REMI法对禾长蠕孢菌HGE原生质体进行转化,拟通过外源质粒pSH75插入到HGE菌基因组中的随机性来获得ophiobolin A合成缺陷型突变株,进而克隆到一个或多个控制毒素合成的功能基因,确定其代谢途径,最终通过基因调控的方法获得大量表达的有效毒素,为培育高效工程菌提供基因资源。研究内容及结果如下:HGE菌原生质体的制备与再生条件研究。由于禾长蠕孢菌为丝状真菌,具有成分复杂的细胞壁结构,能够阻止外源质粒与限制性内切酶进入细胞。所以,建立合适的原生质体制备条件是转化成功的首要工作。同时,原生质体的再生情况直接关系到禾长蠕孢菌的转化率。因而,原生质体制备和再生技术是禾长蠕孢菌转化与基因克隆技术的基础。试验结果表明,禾长蠕孢菌液体培养菌丝体原生质体释放最佳的酶解体系及条件为:0.4mol/L MgSO4溶液作为稳渗剂及酶解缓冲液,0.5%崩溃酶+0.5%裂解酶+0.5%蜗牛酶于26℃条件下酶解菌龄为6h的菌丝体2h;同时,原生质体再生率最高时对应的酶解体系及条件为:32℃条件下,用0.7mol/L NaCl溶液配制的0.5%崩溃酶酶解培养时间为16h的菌丝体4h。从以上的单因素试验结果可知,禾长蠕孢菌菌丝体最佳原生质体制备与再生酶解条件差别较大,综合考虑原生质体制备与再生对于后续实验的影响,选择原生质体再生率最高时对应的酶解体系及条件为最适条件。禾长蠕孢菌原生质体转化及突变体筛选与验证。通过利用质粒pSH75对HGE菌原生质体进行转化后得到了大量的转化子,经过初步的筛选后,摒弃了流产转化子及生长速度不能满足后续试验要求的突变体。采用发酵液抑制水稻纹枯病菌试验、稗草温室生测及HPLC检测毒素含量等实验后初步认定,转化子B014为ophiobolin A毒素合成缺陷型突变体,为本项试验的目的转化子。同时,对多株突变体基因组DNA进行PCR检测后,均得到了目的条带,充分说明了质粒pSH75已经成功插入到转化子的基因组中。Southern blot检测表明pSH75是单拷贝插入转化子B014中,为后续基因克隆奠定基础。另外,在论文研究规定内容之外,研究了禾长蠕孢菌野生型发酵液及粗毒素对水稻细菌性条斑病菌的抑制情况。结果发现,HGE发酵液和粗毒素的MIC(最低抑菌浓度)和MBC(最低杀菌浓度)均低于20%噻菌铜SC、72%农用链霉素SP和20%叶枯唑SP。说明HGE粗毒素具有开发成微生物农药的潜力。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
限制性内切酶介导整合论文参考文献
[1].张鑫,刘爱芬,张玮,严红,乔广行.葡萄溃疡病菌限制性内切酶介导整合方法的建立及转化子库的构建[J].微生物学通报.2013
[2].朱凯.限制性内切酶介导整合法筛选禾长蠕孢菌OphiobolinA合成缺陷型突变体[D].中国农业科学院.2010
[3].郝小丽,韦建福,魏士平,姚元红.限制性内切酶介导整合技术在真菌功能基因研究中的应用[C].中国植病、菌物学会杭州联合年会论文集.2008
[4].李铁民,孟晋.限制性内切酶介导的整合技术[J].辽宁大学学报(自然科学版).2005
[5].伏建国,强胜,朱云枝.链格孢菌原生质体的制备与限制性内切酶介导整合(REMI)转化的致病性诱变[J].菌物学报.2005
[6].伏建国.链格孢菌强产毒菌株的筛选和限制性内切酶介导整合（REMI）转化的产毒诱变[D].南京农业大学.2005