沙葱萤叶甲气味结合蛋白GdauOBP20的基因克隆、原核表达及其结合特性

论文摘要

【目的】沙葱萤叶甲（Galeruca daurica）是近年来在内蒙古草原上暴发成灾的新害虫,本文旨在克隆沙葱萤叶甲气味结合蛋白基因GdauOBP20的cDNA全长序列,明确其重组蛋白与寄主植物挥发物的结合特性,为揭示沙葱萤叶甲嗅觉的分子机理打下基础。【方法】基于沙葱萤叶甲转录组数据,利用RACE技术对沙葱萤叶甲气味结合蛋白基因GdauOBP20进行cDNA全长克隆;利用生物信息学软件预测分析其编码蛋白的理化特性和结构特征;通过原核表达系统表达目的蛋白,并使用Ni-NTA Agarose亲和层析柱进行重组蛋白纯化。最后采用荧光竞争结合的方法,以N-苯基-1-萘胺（N-phenyl-1-naphthylamine,1-NPN）为荧光探针,检测GdauOBP20重组蛋白与13种主要寄主挥发物的结合情况。【结果】GdauOBP20的cDNA全长序列为567 bp（GenBank登录号MK250532）,其中5′末端非编码区长24 bp,3′末端非编码区长123 bp,具有ployA尾结构;开放阅读框（ORF）全长为420 bp,编码139个氨基酸。氨基酸序列中含有4个保守的半胱氨酸位点,属于Minus-C OBP亚家族。预测蛋白三级结构中含有6个α螺旋和两对由半胱氨酸形成的二硫键。成功构建了重组表达载体并获得了高纯度的重组蛋白。重组蛋白GdauOBP20与荧光探针1-NPN的结合常数为12.8μmol·L-1,结合能力较好,可作为本试验的荧光报告子。在所测的13种主要寄主植物挥发物中,除与二烯丙基三硫醚无结合能力外,GdauOBP20重组蛋白与其他12种寄主植物挥发物均有不同程度的结合能力,其中与对二甲苯和环庚三烯的结合能力最强,解离常数分别为22.91和26.55μmol·L-1,而与月桂烯结合能力最弱,解离常数为116.29μmol·L-1。【结论】沙葱萤叶甲GdauOBP20能与寄主植物的多种主要挥发性物质结合,推测其可能在沙葱萤叶甲对寄主植物的定位过程中发挥重要的作用。

论文目录

• 0 引言
• 1 材料与方法
•   1.1 供试昆虫
•   1.2 RNA的提取及c DNA的合成
•   1.3 GdauOBP20全长c DNA克隆
•   1.4 GdauOBP20序列的生物信息学分析
•   1.5 GdauOBP20重组蛋白的诱导表达与纯化
•   1.6 GdauOBP20重组蛋白的配基结合试验
• 2 结果
•   2.1 GdauOBP20全长c DNA的克隆及序列分析
•   2.2 GdauOBP20重组蛋白的表达与纯化
•   2.3 GdauOBP20重组蛋白与配基的结合试验
• 3 讨论
• 4 结论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 李玲,谭瑶,周晓榕,庞保平

关键词: 沙葱萤叶甲,气味结合蛋白,克隆,原核表达,荧光竞争结合试验

来源: 中国农业科学 2019年20期

年度: 2019

分类: 农业科技,基础科学

专业: 生物学

单位: 内蒙古农业大学草原昆虫研究中心

基金: 国家自然科学基金(31360441)

分类号: Q78

页码: 3705-3712

总页数: 8

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