小分子化合物Vc和RG108组合对山羊iPSC-like细胞多能性维持的研究

论文摘要

本研究利用山羊诱导多能干细胞（giPSCs-like）为实验材料,筛选能够促进giPSCs多能性状态维持的小分子化合物,从而优化培养体系。再对优化后的培养体系下获得的giPSCs进行一系列生物学特性检测,同时结合RNA-seq技术和生物信息学分析,探究其促进多能性维持的相关分子机制。1.促进山羊iPSC-like细胞多能性的培养条件筛选（1）通过比对添加单个作用于表观遗传的小分子药物对giPSC-like细胞的影响,以克隆形态,碱性磷酸酶活性以及相关基因的表达量作为鉴定指标,结果发现:Vc组与RG108组可以明显促进克隆的生长速度与维持克隆形态,克隆更加透亮,碱性磷酸酶（AP）活性增强。同时添加Vc组显著提高了组蛋白去甲基化酶KDM2B和DNA去甲基化酶TET1,TET3的表达。添加RG108组降低了 DNA甲基转移酶抑制剂（DNMT1）的表达。（2）进一步筛选小分子组合,结果发现:Vc与RG108（即VR）组合使用时,AP活性更强,同时显著上调TET1,TET3和显著下调DNMT1的表达。另外多能性基因OCT4,SOX2,NANOG的表达量也显著提高,促进多能性的维持。（3）筛选基础培养基发现:DMEM/F12+10%FBS+10%KSR（DFK）的基础培养基明显提高克隆的生长速度和质量,QRT-PCR结果显示该基础培养基结合VR培养细胞时,OCT4,KLF4,NANOG,TET1表达量上调最显著。最终在此基础上完善培养基,发现添加碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）,进一步促进克隆增殖速度和显著上调相关基因表达量,从而确定“DFK-VR+bFGF”（DMEM/F12+10%FBS+10%KSR+DOX+β-巯基乙醇+L-谷氨酰胺+ NEAA+Vc+RG108+bFGF）为优化后的培养体系。（4）“DFK-VR+bFGF”培养体系下获得的giPSCs进行生物学鉴定和无DOX条件培养。结果显示:giPSCs克隆圆润透亮,形态聚拢,呈现山羊正常的染色体核型,共60条染色体。与对照组相比,克隆生长速度快,AP活性强。相对荧光强度结果显示:H3K9me3的荧光强度显著降低,多能性基因SOX2和NANOG的荧光强度显著提高。无DOX培养条件下,“DFK-VR+bFGF”培养体系中能够在一定程度上维持克隆形态。2.山羊iPSC-like细胞在“DFK-VR+bFGF”以及对照组（GIPS）培养体系下转录组测序分析比较根据测序结果,分析“DFK-VR+bFGF”与GIPS两个体系下差异基因显著富集的KEGG通路,找到造成两组多能性差异的关键信号通路,包括有 Wnt signaling pathway,Hippo signaling pathway,PI3K-AKT signaling pathway等。发现激活Wnt信号通路有利于多能性的提升,激活PI3K-AKT信号通路会促进细胞增殖、抑制凋亡和促进糖原生成过程。Hippo信号通路对于有助于giPSCs的增殖、存活和多能性的维持至关重要。综上,我们筛选获得可促进giPSCs多能状态维持的培养体系“DFK-VR+bFGF”,推测该体系可能是通过小分子化合物Vc和RG108降低细胞整体甲基化,从而促进多能性的提升,同时激活了Wnt信号通路,Hippo信号通路和PI3K-AKT信号通路发挥重要作用。上述结果为山羊多能干细胞培养条件的进一步优化提供一定的理论基础,也为促进转基因动物生产以及畜牧业发展奠定基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 综述部分
•   1. 诱导多能干细胞（iPSCs）的研究进展
•     1.1 iPSCs的概述
•     1.2 iPSCs的诱导方法
•       1.2.1 病毒载体法
•       1.2.2 非病毒载体法
•     1.3 iPSCs的应用
•     1.4 山羊iPSCs （giPSCs）的研究进展
•     1.5 细胞重编程为iPSCs的可能机制
•   2. 小分子化合物在体细胞重编程中的研究进展
•     2.1 小分子化合物的概念
•     2.2 小分子化合物促进iPSC重编程
•       2.2.1 小分子作用信号通路促进重编程
•       2.2.2 小分子作用表观遗传促进重编程
•       2.2.3 小分子作用细胞代谢促进重编程
•   3. 细胞重编程中的表观遗传机制
•     3.1 DNA甲基化与重编程
•     3.2 组蛋白甲基化与重编程
•     3.3 组蛋白去乙酰化与重编程
•   4. 转录组测序技术及其在细胞重编程的应用
•     4.1 转录组测序技术概况
•       4.1.1 转录组测序技术定义
•       4.1.2 RNA-seq技术
•     4.2 转录组测序在ESC研究的应用
•     4.3 转录组测序在iPSC研究的应用
•     4.4 转录组测序技术的前景
•   5. 研究目的和意义
• 第二部分 试验部分
•   第一章: 促进山羊iPSC-like细胞多能性的培养条件筛选
•     1 材料与方法
•       1.1 实验材料
•     1.1.1 细胞来源
•     1.1.2 主要试剂
•     1.1.3 主要仪器
•     1.1.4 主要溶液和培养基的配制
•       1.2 实验方法
•     1.2.1 小鼠胎儿成纤维细胞（MEF）原代培养
•     1.2.2 基质胶（Matrigel）包被培养板
•     1.2.3 饲养层（Feeder）细胞制备
•     1.2.4 giPSCs的传代培养
•     1.2.5 giPSC的细胞冻存
•     1.2.6 giPSCs的碱性磷酸酶活性检测
•     1.2.7 细胞中总RNA提取
•     1.2.8 cDNA模板制备
•     1.2.9 PCR反应
•     1.2.10 荧光定量QRT-PCR
•     1.2.11 核型分析
•     1.2.12 免疫荧光染色
•     2 结果与分析
•       2.1 giPSC-like细胞的鉴定
•     2.1.1 DOX的撤除现象
•     2.1.2 giPSC-like细胞系的鉴定
•       2.2 giPSC-like细胞平台筛选作用于表观遗传的培养基
•     2.2.1 作用表观遗传的小分子化合物筛选与鉴定
•     2.2.2 小分子化合物组合的筛选与鉴定
•     2.2.3 VR体系下基础培养基的筛选与鉴定
•     2.2.4 DFK-VR培养基的完善与鉴定
•       2.3 giPSC-like细胞系在DFK-VR+bFGF与GIPS培养体系的鉴定
•     2.3.1 生物学检测的比较
•     2.3.2 无DOX条件下,DFK-VR+bFGF与GIPS培养体系下giPSC的比较
• diff细胞二次重编程'>    2.3.3 giPSCd^diff细胞二次重编程
•     3 讨论与分析
•     4 小结
•   第二章: 山羊iPSC-like细胞在“DFK-VR+bFGF”以及对照组（GIPS）培养体系下转录组测序分析比较
•     1 材料与方法
•       1.1 实验材料
•     1.1.1 细胞来源
•     1.1.2 主要试剂
•     1.1.3 主要仪器
•     1.1.4 主要溶液和培养基的配制
•       1.2 实验方法
•     1.2.1 测序样品中准备
•     1.2.2 测序样品质检
•     1.2.3 建库测序流程
•     1.2.4 生物信息分析流程
•     1.2.5 荧光定量QRT PCR
•     2 结果与分析
•       2.1 测序样品质检
•       2.2 建库测序结果
•       2.3 生物信息分析
•     2.3.1 样品与参考基因组比对情况
•     2.3.2 转录组质量评估情况
•     2.3.3 表达量分析
•     2.3.4 差异表达基因分析
•     2.3.5 GO差异基因对比分析
•     2.3.6 KEGG差异基因对比分析
•     2.3.7 KEGG通路图的关键基因
•     2.3.8 QRT PCR验证测序结果
•     3 讨论与分析
•     4 小结
• 全文结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读硕士期间发表学术论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 郑贝贝

导师: 黄奔,刘庆友

关键词: 山羊,小分子,体系,多能性

来源: 广西大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,生物学,生物医学工程

单位: 广西大学

分类号: Q813;Q811.4

总页数: 89

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