肠道病毒71拮抗天然抗病毒因子A3G机制研究

论文摘要

肠道病毒属于小核糖核酸病毒科,是单股正链RNA病毒,能够引起包括呼吸系统疾病、心肌炎、中枢神经系统疾病以及手足口病在内的很多人类疾病,对世界公共卫生安全造成了很大威胁,EV71、CA6和EVD68都是肠道病毒中致病性很强的病原体。A3G是APOBEC家族的成员,具有胞嘧啶脱氨酶的活性以及RNA结合活性,对于Vif缺陷的HIV-1具有强烈的抗病毒作用。同时,A3G也能够限制其他逆转录病毒以及DNA病毒的复制,具有广谱的抗病毒作用。在我们最新的研究中也发现,A3G对于EV71这种小核糖核酸病毒同样具有抑制作用。病毒在不断地复制繁衍中也进化出了很多拮抗宿主免疫系统的能力,例如HIV-1 Vif通过蛋白酶体途径降解A3G等。在之前的研究中,我们发现了EV71感染的细胞中A3G蛋白水平的下调,这可能是EV71拮抗A3G限制作用导致的,因此我们探究了其中的机制。我们发现,EV71 2C蛋白能够以自噬依赖的方式诱导A3G的降解。首先我们考察了包括2A、2B、2C和3C等在内的EV71非结构蛋白是否诱导A3G降解,发现只有2C具有这一功能。在加入了溶酶体抑制剂Baf A1之后,与对照组相比A3G的蛋白水平回复了,说明2C对于A3G的降解作用可能与自噬-溶酶体途径有关。通过构建2C截短突变体,我们确认了2C降解A3G作用的关键结构域,为N-末端1-53个氨基酸位置。通过进一步的突变,我们将结构域缩小到N-末端第26-40个氨基酸。进而,为了考察其诱导自噬的能力,我们检测了2C及突变体转染入细胞后LC3II型蛋白水平以及自噬斑的形成情况。发现2C降解A3G的结构域也能够诱导细胞自噬作用;以及2C存在时A3G与自噬标志物p62蛋白存在共定位现象。这些都证明了EV71 2C通过自噬-溶酶体途径降解A3G从而拮抗A3G抑制作用。并且包括CA6、CA16、CVB3和EVD68在内的多种肠道病毒的2C均有诱导自噬以及诱导A3G降解的功能。进而我们又探究了A3G抗病毒作用在其他肠道病毒中的普遍性。A3G能够限制EVD68的复制。与我们之前在EV71病毒中的研究相似,在转染A3G后EVD68的mRNA水平以及蛋白水平均有所下降,A3G可能是在mRNA水平限制了EVD68的复制。之后的研究表明,A3G能够抑制EVD68 5’UTR的luciferase活性,证明A3G通过抑制其5’UTR起始复制的活性来抑制病毒复制。但是A3G并不能限制CA6病毒的复制,可能CA6进化出了其他作用抵消了A3G的抑制作用,我们会在之后继续探究这个问题。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
•   1.1 肠道病毒
•     1.1.1 肠道病毒概述
•     1.1.2 肠道病毒与细胞自噬
•   1.2 肠道病毒A71型
•   1.3 肠道病毒D68 型与柯萨奇病毒A6型
•   1.4 APOBEC3G蛋白
•     1.4.1 APOBEC家族
•     1.4.2 APOBEC3G抗病毒功能
•   1.5 创新点
• 第2章 材料与方法
•   2.1 仪器、材料与试剂
•     2.1.1 主要实验仪器
•     2.1.2 主要试剂与材料
•     2.1.3 质粒、细胞系与病毒毒株
•     2.1.4 引物合成与质粒测序
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 突变质粒的构建
•     2.2.2 细胞复苏、细胞传代与转染
•     2.2.3 Western blot实验
•     2.2.4 免疫共沉淀实验
•     2.2.5 免疫荧光共定位实验
•     2.2.6 病毒扩增、病毒滴度测定与病毒的超速离心
•     2.2.7 荧光素酶报告系统实验
•     2.2.8 RT-qPCR
•     2.2.9 shPCBP1-RD细胞系的构建
• 第3章 结果与讨论
•   3.1 EV712C降低A3G的表达
•   3.2 EV712C诱导A3G降解与自噬-溶酶体途径有关
•   3.3 EV712C与A3G具有直接的相互作用
•   3.4 EV712C降解A3G所必需的功能区
•   3.5 EV712C诱导自噬并通过自噬-溶酶体途径降解A3G
•   3.6 2C蛋白自噬依赖的A3G降解功能具有普遍性
•   3.7 A3G限制EVD68病毒而不是CA6病毒复制
•   3.8 A3G通过抑制EVD685'UTR活性抑制病毒复制
•   3.9 讨论
• 结论
• 参考文献
• 作者简介及在学期间所取得的科研成果
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 宁珊珊

导师: 张文艳

关键词: 肠道病毒,病毒与宿主相互作用,自噬

来源: 吉林大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 吉林大学

分类号: R373.2

总页数: 59

文件大小: 3529K

下载量: 52