埃博拉病毒生命周期相关重要宿主因子及抗病毒中和性抗体的研究

论文摘要

埃博拉病毒病（EVD）是由丝状病毒科埃博拉病毒（EBOV）感染人类和非灵长类动物导致的致命性传染性出血性疾病,病死率高。尽管目前针对EVD的研究和治疗取得显著进步,但EBOV在宿主细胞内的生命周期相关分子机制等仍不明确,可用于EVD患者的有效治疗仍非常有限。本研究拟在2级生物安全实验室环境下,构建具备复制和转录基本功能的埃博拉病毒样颗粒（EBOV-trVLPs）,合成靶向与RNA病毒生命周期（病毒入侵、脱壳、融合、复制、装配及出芽等）密切相关的宿主siRNAs,通过RNA干扰（RNAi）来筛选对EBOV-trVLPs复制产生重要影响的宿主蛋白,并验证宿主蛋白与EBOV-trVLPs GP、VP40蛋白及核酸的相互作用关系。通过杂交瘤技术合成抗EBOVGP和VP40单克隆抗体（mAb）,开展体外抗EBOVGP和VP40 mAb单用及联合应用针对EBOV-trVLPs的抗病毒效应研究。在本研究中,我们发现宿主分子伴侣、膜转运蛋白和信号转导蛋白等与EBOV-trVLPs生命周期密切相关,并与trVLPs的GP、VP40蛋白及核酸发生相互作用;证实抗GP和抗VP40 mAb的联合、抗VP40 mAb之间的联合具备协同抗病毒效应。第一部分 埃博拉病毒样颗粒体外复制系统的建立目的:EBOV在宿主细胞内的生命周期仍有诸多不明确之处,但鉴于其生物安全级别定性为4级,极大地限制了研究人员对该种属病毒的研究。因此,本研究拟在2级生物安全实验室构建EBOV-trVLPs,模拟EBOV野毒株的生命周期及基本功能,以期进行后续研究。材料和方法:在2级生物安全实验室环境,应用反向遗传学原理,将携带有EBOV各段基因信息的质粒共转染293T细胞,构建具备复制和转录基本功能的病毒样颗粒（trVLPs）,通过检测trVLPs所携带报告基因的吸光度值监测trVLPs的包装效率,电镜观察trVLPs形态,荧光显微镜观察DiI标记trVLPs入侵293T活细胞过程。结果:从P0-P5代trVLPs报告基因的吸光度值呈现逐渐递增趋势,证明该系统具备稳定复制能力。trVLPs在电镜下主要表现为丝状病毒样颗粒,从大小和形态学上高度模拟EBOV野毒株。DiI标记trVLPs具备侵入活细胞的能力并在细胞内进行运输。结论:在2级生物安全实验室环境中,构建能在体外细胞内稳定复制、并模拟EBOV野毒株的生活周期和基本功能的trVLPs;trVLPs没有生物危害性,具有稳定性和可监测性特点,是研究EBOV的良好载体和工具。第二部分 EBOV-trVLPs生命周期相关的重要宿主因子筛选及相互作用的研究目的:EBOV在宿主细胞内生命周期涉及众多宿主因子,并可能与之发生相互作用,但其中涉及的宿主因子、发生机制和相互作用关系等仍有诸多不明确之处。材料和方法:我们在EBOV-trVLPs构建的基础上,合成靶向与RNA病毒生命周期（病毒的入侵、脱壳、融合、复制、装配及出芽等）密切相关的宿主siRNAs,通过RNA干扰技术（RNAi）来筛选对EBOV-trVLPs复制产生重要影响的宿主蛋白,应用免疫共沉淀、染色质免疫共沉淀、蛋白免疫印迹等方法初步明确宿主蛋白与EBOV-trVLPs GP、VP40蛋白及核酸是否存在相互作用关系。结果:SiRNAs 敲减 ANXA5、ARFGAP1、FLT4、GRP78、HSPA1A、HSP90AB1、HSPA8、MAPK11、MEK2、NTRK1和YWHAZ等11个宿主蛋白后能有效抑制trVLPs复制（p<0.05）,其中 FLT4、GRP78、HSPA1A、HSP90AB1、HSPA8、MAPK11、MEK2、NTRK1和YWHAZ等9个蛋白与GP存在相互作用;ANXA5、GRP78、HSPA1A和HSP90AB1等 4 个蛋白与 VP40 具有相互作用;HSP90AB1、ANXA5、ARFGAP1、FLT4、GRP78、HSPA1A、MEK2、NTRK1和MAPK11等9个蛋白与trVLPs核酸具有相互作用。结论:我们系统性评估了宿主分子伴侣、膜转运蛋白和信号转导蛋白与EBOV-trVLPs生命周期密切相关,并与trVLPs的GP、VP40蛋白及核酸发生相互作用。第三部分 抗埃博拉病毒GP和VP40单克隆抗体体外抗病毒效应的研究目的:单克隆抗体（mAb）是当前治疗EVD的有效方法之一。目前,抗EBOV抗体多限于抗GP蛋白抗体,抗体联合应用也仅限于抗GP抗体之间的联合,关于抗GP和抗VP40抗体之间联合应用尚未见报道。因此,我们拟在EBOV-trVLPs基础上,开展抗GP和抗VP40抗体联合抗病毒效应的研究。材料和方法:我们通过杂交瘤技术合成抗EBOVGP和VP40mAb,在构建EBOV-trVLPs复制系统的基础上,应用RT-PCR、蛋白免疫印迹及细胞原位荧光等方法开展体外抗EBOV GP和VP40 mAb对EBOV-trVLPs的抗病毒效应研究,并验证抗EBOVGP和VP40 mAb联合应用的抗病毒效应。结果:抗GP和抗VP40 mAb单独应用在5-10μg/ml剂量下能有效抑制trVLPs复制（P<0.05）;抗GP和抗VP40mAb、抗VP40mAb之间的两两联合（抗体的鸡尾酒疗法）与抗体单独应用对比,在总剂量相等情况下,具有更显著的抗病毒作用（P<0.01）,提示联合应用具有协同抗病毒效应。结论:本研究进行了体外抗EBOV GP和抗VP40mAb的抗病毒效应的研究,并证实抗GP和抗VP40mAb的联合、抗VP40 mAb之间的联合具备协同抗病毒效应,抗体靶向作用位点及协同作用机制有待于进一步研究。

论文目录

• 致谢
• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略词表
• 第一部分 埃博拉病毒样颗粒体外复制系统的建立
•   1.1 背景
•   1.2 材料和方法
•     1.2.1 主要实验试剂和耗材
•     1.2.2 细胞系和质粒
•     1.2.3 质粒扩增、抽提与鉴定
•     1.2.4 trVLPs的构建
•     1.2.5 电镜观察trVLPs
•     1.2.6 DiI标记的trVLPs入侵活细胞过程观察
•     1.2.7 trVLPs的半数培养组织感染剂量（50% Tissue Culture Infective Dose,TCID50）测定
•   1.3 实验结果
•     1.3.1 EBOV-trVLPs模型能在体外细胞实验中稳定复制表达
•     1.3.2 EBOV-trVLPs能在2级生物安全实验室从大小和形态学上模拟EBOV野毒株
•     1.3.3 DiI-trVLPs入侵活细胞过程示踪
•   1.4 讨论
•   1.5 参考文献
• 第二部分 EBOV-trVLPs生命周期相关重要宿主因子的筛选及相互作用的研究
•   2.1 背景
•   2.2 材料和方法
•     2.2.1 主要实验试剂和耗材
•     2.2.2 细胞系和质粒
•     2.2.3 SiRNAs库的建立
•     2.2.4 SiRNAs筛选流程
•     2.2.5 RNAi与trVLPs感染
•     2.2.6 RNA抽提及RT-PCR检测siRNAs敲减后细胞内trVLPs -RNA水平
•     2.2.7 候选宿主蛋白抗体
•     2.2.8 免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation,CO-IP）及蛋白免疫印迹实验
•     2.2.9 染色质免疫共沉淀（Chromatin immunoprecipitation,ChIP）
•     2.2.10 数据分析
•   2.3 实验结果
•     2.3.1 候选宿主蛋白与trVLPs-GP相互作用
•     2.3.2 候选宿主蛋白与trVLPs-VP40相互作用
•     2.3.3 候选宿主蛋白与trVLPs核酸相互作用
•   2.4 讨论
•   2.5 参考文献
• 第三部分 抗埃博拉病毒GP和VP40单克隆抗体的抗病毒效应研究
•   3.1 背景
•   3.2 材料和方法
•     3.2.1 主要实验试剂和耗材
•     3.2.2 抗EBOV-GP和VP40单克隆抗体
•     3.2.3 细胞和质粒
•     3.2.4 trVLPs包装、检测
•     3.2.5 RT-PCR验证GP及VP40-mAbs体外抗trVLPs效应
•     3.2.6 蛋白免疫印迹验证GP及VP40-mAbs体外抗trVLPs效应
•     3.2.7 细胞原位免疫荧光分析GP及VP40-mAbs抗trVLPs效应
•     3.2.8 抗体可变域测序
•     3.2.9 数据分析
•   3.3 实验结果
•     3.3.1 抗GP和抗VP40抗体具备抗trVLPs效应
•     3.3.2 抗GP和抗VP40抗体、抗VP40抗体之间的联合（抗体的鸡尾酒疗法）具有协同抗病毒效应
•     3.3.3 抗体测序
•   3.4 讨论
•   3.5 参考文献
• 综述
•   参考文献
• 附录
• 个人简历及攻读博士学位期间所取得的科研成果

文章来源

类型: 博士论文

作者: 余东山

导师: 李兰娟

关键词: 埃博拉病毒,单克隆抗体,抗病毒效应,生命周期,级生物安全实验室,宿主蛋白病毒蛋白相互作用,宿主蛋白病毒核酸相互作用,抗体联合应用

来源: 浙江大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,生物学,基础医学,基础医学

单位: 浙江大学

分类号: R373;R392

DOI: 10.27461/d.cnki.gzjdx.2019.001212

总页数: 160

文件大小: 7921K

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