朊病毒在小鼠和仓鼠之间传播屏障的分子机制研究

论文摘要

目的:朊病毒疾病是由朊蛋白错误折叠引起的一类神经退行性疾病,也称为传染性海绵状脑病。错构的朊蛋白结构中α螺旋结构比例下降,β折叠结构比例上升,造成这种错构朊蛋白积聚成纤维状,引发神经细胞的凋亡。这种错构的朊蛋白被称为朊病毒,可通过食物、血液等在动物中传播,进入宿主内的朊病毒可诱导宿主正常朊蛋白错构,从而完成疾病的传染。朊病毒在小鼠和仓鼠之间传播具有屏障作用,表现为实验动物的发病的潜伏期延长,发病率低下。除了株系的原因之外,朊病毒的传播屏障主要是由异源朊蛋白的氨基酸位点的差异造成的。小鼠和仓鼠存在11个氨基酸位点的不同,且每个位点对小鼠和仓鼠之间朊病毒传播的影响程度不同。我们在仓鼠朊蛋白的基础上构建了不同的向小鼠朊蛋白氨基酸突变的多位点突变体朊蛋白,利用PMC A技术和体外重组朊蛋白技术,探究不同位点组合能否跨越朊病毒在小鼠和仓鼠之间传播的种属屏障。方法:在合成的质粒模板上,设计多个位点的突变引物,由仓鼠向小鼠突变。得到的突变载体模板经测序正确后,转化进BL21大肠杆菌,挑选单克隆并进一步诱导表达重组朊蛋白。将得到的重组朊蛋白与小鼠朊病毒(PrPSc)一起进行PM CA实验,观察小鼠朊病毒能否诱导多点位突变仓鼠朊蛋白产生错构,通过PK消化处理PMCA产物检测其PK抗性进行验证。结果:成功构建了7个多点突变的重组朊蛋白基因,其中包括4个3突变位点、2个4突变位点和1个5突变位点。经测序正确后,转化大肠杆菌诱导表达,经过Ni-NTA亲和层析后得到重组蛋白。在配制底物体系后,与小鼠PrPSc进行P MCA实验,检验转化结果。结果显示HaPrP（M111V-M138I-I204M）转化的构象得到了经PK消化后具有致病能力的17 kD片段,其他突变体都出现了经PK消化后的无致病能力的14 kD片段。结论:PMCA结果显示,经过PK消化后,在7种突变体里面只有HaPrP（M111V-M138I-I204M）这个突变体得到了17 kD片段的致病构象,没有出现无致病的14 kD片段无致病构象。而其他3突变体及更多位点的4突变体和5突变体既得到经PK消化的无致病构象14 kD片段也得到了经PK消化有致病构象的17 kD片段,这2种不同构象的同时存在可能不会使接种的动物患病,无法实现跨越种属屏障。同时M111V、M138I和I204M与先前得到的影响小鼠-仓鼠朊病毒传播的G54ins、I138M和M204I 3个位点结果并不完全一致。说明单个氨基酸位点作用并不是简单的叠加效果,有可能这些位点还存在空间上的相互作用。本文通过重组朊蛋白和PMCA技术,得到了克服小鼠和仓鼠种属屏障的3突变朊蛋白,阐述了小鼠和仓鼠朊病毒种属间传播的关键氨基酸位点,进一步验证了构象选择理论。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 综述
• 第一章 朊蛋白突变体载体的构建
•   1.1 前言
•   1.2 技术路线
•   1.3 试验材料
•     1.3.1 菌种与质粒
•     1.3.2 主要配方
•   1.4 实验方法
•     1.4.1 引物设计
•     1.4.2 引物的稀释与保存
•     1.4.3 制备感受态
•     1.4.4 定点突变
•     1.4.5 琼脂糖凝胶电泳
•     1.4.6 模板质粒的消化
•     1.4.7 PCR突变产物转化感受态
•     1.4.8 质粒小抽
•     1.4.9 测序
•   1.5 实验结果
•     1.5.1 引物的设计与合成
•     1.5.2 PCR产物的鉴定
•     1.5.3 质粒测序与比对
•   1.6 分析与讨论
• 第二章 突变体朊蛋白的表达与纯化
•   2.1 前言
•   2.2 技术路线
•   2.3 实验材料
•     2.3.1 菌种和质粒
•     2.3.2 主要试剂配方
•   2.4 实验方法
•     2.4.1 表达质粒的转化
•     2.4.2 重组朊蛋白的大肠杆菌表达
•     2.4.3 Ni-NTA亲和层析柱的制备
•     2.4.4 重组朊蛋白的纯化
•     2.4.5 纯化后朊蛋白定量
•     2.4.6 蛋白质SDS-PAGE凝胶电泳
•     2.4.7 蛋白质免疫印迹（Western Blot,WB）检测
•   2.5 实验结果
•     2.5.1 蛋白亲和层析结果
•     2.5.2 BCA定量结果
•     2.5.3 突变体朊蛋白的考马斯亮蓝鉴定
•     2.5.4 突变体朊蛋白的蛋白免疫印迹鉴定
•   2.6 分析与讨论
• 第三章 重要氨基酸位点对小鼠朊病毒和仓鼠朊病毒传播种属屏障影响
•   3.1 前言
•   3.2 实验材料及试剂
•   3.3 实验路线
•   3.4 实验方法
•     3.4.1 制备POPG脂质体囊泡
•     3.4.2 小鼠肝脏的总RNA提取
•     3.4.3 PMCA底物的配制
•     3.4.4 PMCA超声实验
•   3.5 结果与分析
•   3.6 讨论与分析
• 参考文献
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 魏顺雄

导师: 马继延

关键词: 朊病毒,种属屏障,多点突变,构象转变,蛋白酶抗性

来源: 华东师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 华东师范大学

分类号: R373

总页数: 71

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