组蛋白分子伴侣ASF1调控小鼠植入前胚胎发育机理研究

论文摘要

ASF1（Anti-Silencing Factor 1）是一种组蛋白分子伴侣,在哺乳动物中具有ASF1A和ASF1B两个亚型。在功能方面,对核小体组装、DNA损伤修复以及转录调控具有重要的意义。然而,当前针对ASF1在小鼠植入前胚胎发育过程中的功能所知甚少。因此,本研究重点探索对了ASF1在小鼠受精卵发育过程以及植入前胚胎发育过程中的功能。首先,我们对ASF1A和ASF1B在小鼠受精卵中动态进行了检测。通过获取小鼠受精卵各个发育阶段（受精后2 h、4 h、6 h、8 h、10 h）的细胞,利用免疫荧光技术对细胞核内蛋白进行定量研究。免疫荧光结果显示,ASF1A和ASF1B在小鼠受精卵各个发育阶段均有表达,并且随着雌雄原核的逐渐形成,二者在细胞核内的含量逐渐增加。其次我们通过免疫荧光以及实时荧光定量PCR对ASF1A和ASF1B在小鼠植入前胚胎发育各个阶段细胞核内的含量以及mRNA总量进行了检测。免疫荧光结果显示,ASF1A和ASF1B在卵子和植入前胚胎各个阶段均有表达,但具有不同的变化动态。ASF1A细胞核中的含量在桑椹胚阶段最低,而ASF1B在四细胞阶段细胞核中的含量最低。实时荧光定量PCR结果表明,AF1A和ASF1B mRNA总量在受精后显著减少,在桑椹胚阶段出现表达高峰。此外ASF1B mRNA总量在合子阶段也处于较高水平。接着,我们对ASF1在小鼠植入前胚胎发育过程中的功能进行了研究。利用ASF1A和ASF1B特异性的siRNA以及Morpholino（MO）分别从转录水平以及翻译水平对ASF1A和ASF1B进行了敲减,进一步研究ASF1在小鼠植入前胚胎发育过程中的作用。实验结果表明,ASF1A敲低对小鼠植入前胚胎发育影响很小,但ASF1B敲低导致小鼠植入前胚胎发育率显著降低。最后,因为ASF1B的敲低会导致植入前胚胎发育率显著降低,并且先前研究表明ASF1对H3K56具有乙酰化作用。因此我们通过MO将ASF1B进行敲低,收集囊胚,利用免疫荧光技术,探究H3K56乙酰化水平的变化状况。结果表明,ASF1B的敲低会导致囊胚阶段组蛋白H3K56乙酰化水平降低。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 缩略词表
• 第一章 ASF1的研究进展（文献综述）
•   1 ASF1 概述
•     1.1 ASF1 的发现与命名
•     1.2 ASF1 的序列与结构
•     1.3 ASF1 的分布
•   2 ASF1 的生物学功能
•     2.1 ASF1在核小体组装过程中的功能
•     2.2 ASF1 在组蛋白修饰中的功能
•     2.3 ASF1 在细胞增殖中的功能
•     2.4 ASF1在DNA损伤应答方面的功能
•     2.5 ASF1 在生殖方面的功能
• 第二章 组蛋白分子伴侣ASF1 调控小鼠植入前胚胎发育机理研究（实验部分）
•   1 引言
•   2 实验材料
•     2.1 实验动物
•     2.2 主要实验仪器
•     2.3 实验相关试剂
•     2.4 抗体
•     2.5 常用溶液的配置
•   3 实验方法
•     3.1 体外受精
•     3.2 小鼠生发泡期及减数分裂中期卵子的收集
•     3.3 免疫荧光
•     3.4 卵母细胞和早期胚胎的总RNA提取
•     3.5 总RNA反转录成CDNA
•     3.6 荧光定量PCR
•     3.7 显微注射
•     3.8 NIH3T3 细胞培养
•     3.9 细胞转染
•     3.10 细胞总蛋白的提取
•     3.11 蛋白浓度测定
•     3.12 免疫印迹
•     3.13 流式细胞技术分析细胞周期
•   4 实验结果分析
•     4.1 ASF1A和 ASF1B在小鼠受精卵中的动态变化
•       4.1.1 免疫荧光检测小鼠受精卵中ASF1A动态变化
•       4.1.2 免疫荧光检测小鼠受精卵中ASF1B动态变化
•     4.2 ASF1A和 ASF1B在小鼠植入前胚胎发育过程中的动态变化
•       4.2.1 免疫荧光检测ASF1A在小鼠植入前胚胎发育过程中的动态变化
•       4.2.2 免疫荧光检测ASF1B在小鼠植入前胚胎发育过程中的动态变化
•     4.3 ASF1A和 ASF1B在小鼠植入前胚胎发育过程中mRNA总量变化
•     4.4 敲低ASF1A和 ASF1B对 NIH3T3 细胞周期的影响
•       4.4.1 siRNA敲低效率检测
•       4.4.2 敲低ASF1A和 ASF1B表达对细胞周期的影响
•     4.5 ASF1A和 ASF1B在小鼠植入前胚胎发育过程中的功能研究
•       4.5.1 利用特异性siRNA敲减ASF1A表达研究其对植入前胚胎发育的影响
•     4.5.1.1 ASF1A-siRNA敲减效率检测
•     4.5.1.2 ASF1A-siRNA敲减对植入前胚胎发育的影响
•       4.5.2 利用特异性siRNA敲减ASF1B表达研究其对植入前胚胎发育的影响
•     4.5.2.1 ASF1B-siRNA敲减效率检测
•     4.5.2.2 ASF1B-siRNA敲减对植入前胚胎发育的影响
•       4.5.3 利用特异性ASF1A-MO敲减ASF1A对植入前胚胎的影响
•     4.5.3.1 ASF1A-MO敲减效率检测
•     4.5.3.2 ASF1A-MO敲减对植入前胚胎发育的影响
•       4.5.4 利用特异性ASF1B-MO敲减ASF1B对植入前胚胎的影响
•     4.5.4.1 ASF1B-MO敲减效率检测
•     4.5.4.2 ASF1B-MO敲减对植入前胚胎发育的影响
•     4.6 ASF1B对组蛋白H3K56 乙酰化的影响
•       4.6.1 H3K56ac在小鼠植入前胚胎发育过程中的动态变化
•       4.6.2 ASF1B在胚胎中的敲低对H3K56 乙酰化的影响
•   5 讨论
•   6 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 窦杰

导师: 那顺布和

关键词: 分子伴侣,小鼠,植入前胚胎,卵母细胞

来源: 内蒙古大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 内蒙古大学

分类号: Q344

总页数: 66

文件大小: 2635K

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