裂解性多糖单加氧酶产生活性氧驱动木质素生物降解

论文摘要

裂解性多糖单加氧酶（Lytic polysaccharide monooxygenases,LPMO）是一类广泛存在于真菌、细菌中的单铜氧化酶。当外源电子供体及氧存在时,LPMO活性中心可形成Cu-氧中间体,氧化断裂纤维素或半纤维素。但是木质素抗性屏障通常会限制酶与纤维素或半纤维素的结合,当LPMO结合受阻时,Cu-氧中间体则释放出活性氧并产生与木质素生物降解密切相关的H2O2。如果LPMO能够通过产生H2O2或者其他途径参与并促进木质素生物降解,将在木质素的生物降解以及解除碳素循环的限制因素方面意义重大,然而目前对LPMO是否参与木质素降解及其机制知之甚少。因此本论文针对LPMO是否参与木质素的生物降解及其机制如何这一科学问题,基于功能基因组学研究了LPMO与木质素降解修饰过氧化物酶（lignin-degrading and-modifying peroxidase,LDMPE）之间的可能关联。在此基础上,通过体内外实验揭示了以木质素降解真菌—白腐菌为主的LPMO参与降解木质素的途径和机制。论文主要研究结论如下:（1）真菌、细菌LPMO和LDMPE之间共发生具有普遍性对71株木质纤维素降解菌进行功能基因组比较分析结果显示:88.7%的基因组中都存在LPMO。基因组中的LPMO与木质素降解修饰酶（lignin-degrading and-modifying enzyme,LDME）之间普遍存在共发生现象,且主要发生在LPMO和LDMPE之间。98.2%的真菌基因组中LPMO和LDME共发生,其中白腐菌基因组中的LPMO和LDPME之间的共发生性具有普遍性占83.9%。细菌基因组中LPMO和LDME之间的共发生性为46.7%,主要存在于细菌,尤其放线菌门为主的LPMO与关键LDMPE—染料脱色过氧化物酶（dye-decolorizing peroxidase,DyP）之间。真菌和细菌基因组中的LPMO与LDMPE在数量上均具有较强相关性（r>0.6）,其中在具有较强木质素降解能力的白腐菌（真菌）和放线菌门（细菌）中相关性最高。表明LPMO与LDMPE在基因组层面上存在关联,尤其是在木质素降解能力最强的白腐菌中相关性最高,达到0.807,可能与木质素降解相关。（2）揭示了白腐菌LPMO介导木质素降解的不同途径及机制异源表达获得了来源于白腐真菌Pleurotus ostreatus BP3的且具有生物活性的PoLPMO9A,并且从其电子供体等方面明确了其反应特征。基于此进一步从体外驱动的LDMPE反应和增强醌-氢醌氧化还原循环所诱导的芬顿反应途径等2个方面研究了LPMO介导的木质素降解新机制。结果表明,当存在Ⅱ型过氧化物酶PsVP（真菌LDMPE）及相应的还原剂时,还原型LPMO产生的H2O2优先被PsVP利用,驱动PsVP实现单体、二聚体木质素模型化合物和木质素高分子的降解。碱木素和天然木质素高分子被LPMO-PsVP体系降解后木质素衍生物总相对丰度分别下降了17.1%和6.3%。另一方面,LPMO与漆酶等木质素酶类似,可以氢醌为电子供体将其氧化为半醌自由基,同时产生H2O2并促进Fe3+还原参与并增强醌氧化还原循环诱导的芬顿反应,显著促进羟自由基（HO·）产生。LPMO介导的芬顿反应机制是半醌驱动的芬顿反应机制。H2O2的产生和Fe3+的还原与氢醌种类、氢醌的含量及LPMO的含量有关。在500?M 2,6-二甲氧基-1,4-对苯二酚（DBQH2）条件下,HO·含量较无LPMO的氢醌氧化还原体系提高了2.77倍。由此揭示LPMO可作为辅助酶,通过驱动LDMPE反应和增强醌氧化还原循环诱导的芬顿反应等2条途径,参与木质素的降解。（3）利用链霉菌验证了LPMO体内外介导木质素降解功能以Streptomyces coelicolor M145（ScM145）为对象,从体外和体内两个方面证实了LPMO参与了生物体对木质素的降解。克隆和同源表达了2条在木质素基质存在条件下相对转录水平上调最显著（311倍）的LPMO基因Sclpmo10B和Sclpmo10D,通过接合转移获得了同源过表达LPMO的重组链霉菌Sc M145-ΔLPMO10B（+）和ScM145-ΔLPMO10D（+）。体外实验表明链霉菌来源的LPMO也能够通过驱动LDMPE反应和芬顿反应途径参与木质素降解。体内功能验证表明,较野生型链霉菌ScM145相比,过表达LPMO链霉菌ScM145-ΔLPMO10B（+）和ScM145-ΔLPMO10D（+）对木质素的降解能力显著增强,降解木质素9天后,木质素衍生物总丰度分别下降25.4%和31.0%,较野生型ScM145分别增强了2.65和3.23倍,同时过表达菌株的铁还原能力和木质素解聚释放的总酚含量也显著提高。由此证实了来自于白腐菌等的LPMO在木质素降解中可能发挥作用,且分属于不同门中的实验菌株LPMO具有同样的机制参与木质素降解途径。综上所述,本研究首次发现并揭示了LPMO以不同的反应途径及机制介导白腐菌等的木质素生物降解。相关研究结果不仅拓展LPMO的生物学功能,明晰了LPMO在木质纤维素腐朽中的新作用,也为进一步明晰木质纤维素生物降解的机制奠定了理论基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 论文主要缩略语
• 1 绪论
•   1.1 裂解性多糖单加氧酶
•     1.1.1 裂解性多糖单加氧酶功能多样性
•     1.1.2 裂解性多糖单加氧酶结构特点及催化机制
•     1.1.3 裂解性多糖单加氧酶电子供体及与氧化还原酶之间的相互作用
•     1.1.4 裂解性多糖单加氧酶过氧化氢产生机制
•   1.2 木质素的生物降解
•     1.2.1 木质素降解修饰酶系
•     1.2.2 小分子活性氧反应
•   1.3 木质纤维素基质中真菌LPMO的分泌和表达
•   1.4 LPMO的比较基因组学研究
•   1.5 课题研究的目的、研究思路和研究内容
• 2 木质纤维素降解菌比较基因组研究
•   2.1 引言
•   2.2 材料与方法
•     2.2.1 基因组数据来源
•     2.2.2 基因功能注释
•     2.2.3 LPMO和木质素降解修饰过氧化物酶进化树构建
•     2.2.4 数据分析方法
•   2.3 结果与讨论
•     2.3.1 木质纤维素降解菌的选择及生物多样性系统分类
•     2.3.2 碳水化合物活性酶CAZyme比较
•     2.3.3 基因组纤维素、半纤维素水解酶比较
•     2.3.4 基因组辅助活性家族蛋白（AA）比较
•     2.3.5 裂解性多糖单加氧酶和木质素降解修饰酶比较
•   2.4 本章小结
• 3 白腐菌LPMO的表达及性质
•   3.1 引言
•   3.2 材料与方法
•     3.2.1 菌株和质粒
•     3.2.2 培养基
•     3.2.3 试剂
•     3.2.4 引物设计
•     3.2.5 RNA的提取及cDNA的合成
•     3.2.6 RNA的检测
•     3.2.7 Polpmo9A全长基因的克隆
•     3.2.8 重组表达载体pPICzαA-Polpmo9A的构建
•     3.2.9 PoLPMO9A蛋白在毕赤酵母中的异源表达
•     3.2.10 重组蛋白PoLPMO9A的纯化
•     3.2.11 重组蛋白PoLPMO9A活性鉴定
•     3.2.12 重组蛋白PoLPMO9A电子供体的筛选
•     3.2.13 PoLPMO9A与纤维素酶协同对多糖的氧化降解
•   3.3 结果与讨论
•     3.3.1 裂解性多糖单加氧酶Polpmo9A基因克隆及载体构建
•     3.3.2 PoLPMO9A蛋白序列分析及比对
•     3.3.3 PoLPMO9A在毕赤酵母中的表达及纯化
•     3.3.4 MALDI-TOF/TOF MS分析重组PoLPMO9A活性
•     3.3.5 PoLPMO9A芳香族酚类化合物电子供体的筛选
•     3.3.6 PoLPMO9A与纤维素酶协同对多糖的氧化降解
•   3.4 本章小结
• 4 白腐菌LPMO驱动的木质素体外降解机制
•   4.1 引言
•   4.2 材料与方法
•     4.2.1 菌株和质粒
•     4.2.2 培养基
•     4.2.3 试剂
•     4.2.4 多功能过氧化物酶PsVP的表达、纯化及酶活力测定
•     4.2.5 抗坏血酸及PoLPMO9A浓度对抗坏血酸氧化和过氧化氢产生的影响
•     4.2.6 PoLPMO9A驱动PsVP活性对木质素的降解及分析
•     4.2.7 微晶纤维素对LPMO的吸附试验
•     4.2.8 重组酶底物动力学研究
•     4.2.9 PoLPMO9A对氢醌的氧化及含量测定
•     4.2.10 过氧化氢含量的测定
• 3+还原的测定'>    4.2.11 螯合Fe³⁺还原的测定
•     4.2.12 HO·含量的测定
•     4.2.13 PoLPMO9A增强的芬顿反应对木质素模型化合物的氧化
•     4.2.14 电子顺磁共振（EPR）光谱测定半醌自由基
•   4.3 结果与讨论
•     4.3.1 PoLPMO9A驱动的多功能过氧化物酶对木质素的降解
•     4.3.2 LPMO驱动的多功能过氧化物酶对木质素降解机制
•     4.3.3 LPMO介导氢醌氧化的芬顿反应
•     4.3.4 LPMO增强醌-氢醌氧化还原循环诱导的芬顿反应机制
•   4.4 本章小结
• 5 链霉菌LPMO驱动的木质素体内外降解功能验证
•   5.1 引言
•   5.2 材料与方法
•     5.2.1 菌株和质粒
•     5.2.2 培养基
•     5.2.3 试剂
•     5.2.4 天蓝色链霉菌基因组中裂解性多糖单加氧酶信息分析
•     5.2.5 天蓝色链霉菌裂解性多糖单加氧酶相对转录水平
•     5.2.6 天蓝色链霉菌DNA及裂解性多糖单加氧酶基因的PCR扩增
•     5.2.7 重组链霉菌表达载体的构建
•     5.2.8 大肠杆菌-天蓝色链霉菌属间接合转移
•     5.2.9 过表达LPMO天蓝色链霉菌的诱导培养、蛋白纯化及SDS-PAGE分析
•     5.2.10 ScLPMO10D活性鉴定
•     5.2.11 ScLPMO10D体外增强醌-氢醌氧化还原循环诱导的芬顿反应
•     5.2.12 ScLPMO10D驱动染料脱色过氧化物酶对木质素的降解
•     5.2.13 过表达链霉菌总木质素降解修饰过氧化物酶活力及还原力测定
•     5.2.14 过表达链霉菌对可溶性碱木素的降解及表征
•   5.3 结果与讨论
•     5.3.1 天蓝色链霉菌基因组裂解性多糖单加氧酶分析
•     5.3.2 木质素存在条件下天蓝色链霉菌裂解性多糖单加氧酶相对转录水平
•     5.3.3 天蓝色链霉菌Sclpmo10B和 Sclpmo10D基因获取及表达载体构建
•     5.3.4 天蓝色链霉菌Sclpmo10B和 Sclpmo10D蛋白的表达及纯化
•     5.3.5 ScLPMO10D体外增强醌-氢醌氧化还原循环诱导的芬顿反应
•     5.3.6 ScLPMO10D体外驱动染料脱色过氧化物酶对木质素的降解
•     5.3.7 过表达LPMO链霉菌对木质素的降解
•     5.3.8 过表达链霉菌总木质素降解修饰过氧化物酶和还原力的测定
•   5.4 本章小结
• 6 全文总结
•   6.1 主要研究结论
•   6.2 主要创新性
•   6.3 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录1 攻读学位期间发表论文目录
• 附录2 PoLPMO9A核苷酸序列及蛋白质序列
• 附录3 ScLPMO10B核苷酸序列及蛋白质序列
• 附录4 ScLPMO10D核苷酸序列及蛋白质序列
• 附录5 基因组碳水化合物活性酶数量及分布
• 附录6 基因组纤维素和半纤维素酶数量及分布
• 附录7 基因组辅助活性蛋白数量及分布
• 附录8 LPMO和 LDME基因的相关性分析数据
• 附录9 PoLPMO9A驱动PsVP活性对照试验

文章来源

类型: 博士论文

作者: 李飞

导师: 张晓昱

关键词: 裂解性多糖单加氧酶,木质素降解修饰过氧化物酶,功能基因组学,芬顿反应,木质素生物降解

来源: 华中科技大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 华中科技大学

分类号: Q55

DOI: 10.27157/d.cnki.ghzku.2019.004446

总页数: 208

文件大小: 8317K

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