蛋白激酶YihE的细胞通路及调控机制

论文摘要

现今,越来越多超级抗药细菌的出现对人类的健康产生了严重的威胁。面对众多的多重抗药致病菌,单靠开发新药的传统方法是远远不够的,我们亟需新的策略。因此,近年来人们开始关注细菌耐药性的分子机理,希望以此找到新的突破点。我们前期的研究表明,大肠杆菌(Escherichia coli)YihE激酶是细胞程序性死亡途径的关键调控因子,在抗生素处理细菌时能起到保护细菌的作用。然而,YihE激酶的细胞通路及其在细胞内的调控机制尚不清楚。为了了解YihE的具体调控机制,在本论文工作中我们首先利用转录组测序筛选出表达受yihE突变影响的基因。通过对相关基因的功能进行分析发现,受yihE突变影响的通路主要有硝酸盐还原途径、ED途径(戊糖磷酸途径)以及葡萄糖代谢及转运相关途径。通过药敏实验发现这些途径中的narK、gntK、fruK、gntT、edd、narG和ptsG等基因在萘啶酸处理时对细菌具有保护作用。对于硝酸盐还原途径的关键酶NarG的研究表明,硝酸盐还原酶NarG通过为细菌药物外排泵提供质子驱动力而保护细胞。同时,△yihE突变株中NO水平升高说明YihE对于细胞的保护作用涉及到硝化应激。药物处理条件下△yihE突变株相对于野生型菌株胞内游离铁水平与ROS水平均上升,表明YihE可能通过控制细胞内游离铁水平进而降低细胞内活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平,从而起到对细菌的保护作用。因此,我们提出YihE的细胞通路及调控机制:1)YihE通过磷酸化其靶蛋白,调控细胞内硝酸盐代谢,使细胞内活性氮(Reactive Nitrogen species,RNS)水平不至于过高影响到细胞的存活;2)YihE可能磷酸化DnaK,DnaK负调控ED途径以减少ROS对细菌的毒害作用,最终避免细胞死亡。本研究揭示了 YihE激酶的部分通路及其调控机制,为我们今后针对细菌自我保护机制开发药物,提高现有药物的杀菌效率提供了理论依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
•   1.1 蛋白激酶YihE概述
•   1.2 细菌应激反应系统
•   1.3 氧化应激
•     1.3.1 抗生素诱导ROS生成
•     1.3.2 ROS导致DNA损伤
•   1.4 细菌抗药的分子机制
•   1.5 研究目的与意义
• 第二章 材料与方法
•   2.1 菌株及培养条件
•   2.2 引物和探针
•   2.3 检测细菌对药物的敏感性
•   2.4 转录组测序
•   2.5 Real-time PCR检测基因表达量
•     2.5.1 RNA提取
•     2.5.2 反转录
•     2.5.3 Real-time PCR
•   2.6 细胞外排泵活性检测
•   2.7 细菌胞内ROS检测
•   2.8 ICP-MS测细胞内游离铁离子
•   2.9 EPR顺磁共振检测细胞内游离铁离子
•   2.10 细菌胞内NO含量检测
• 第三章 结果
•   3.1 转录组测序检测△yihE突变株中基因表达的变化
•     3.1.1 △yihE突变株中基因表达的变化
•     3.1.2 差异表达基因代谢通路分析
•     3.1.3 表达显著变化基因的q-PCR验证及其突变株的药敏特性
•   3.2 YihE与硝酸盐还原途径的关系
•     3.2.1 硝酸盐还原途径突变株对药物的敏感性
•     3.2.2 NarG的作用机理
•   3.3 YihE影响细胞内游离铁水平
•     3.3.1 dnaK突变株中edd, narG基因的表达
•     3.3.2 ICP-MS检测△dnaK突变株中游离铁离子
•     3.3.3 EPR顺磁共振检测△yihE突变株中游离铁离子
•   3.4 YihE影响细胞内ROS水平
•     3.4.1 不同条件下野生型菌株胞内ROS水平
•     3.4.2 △yihE及相关突变株胞内ROS水平
• 第四章 讨论
•   4.1 YihE与戊糖磷酸（ED）途径
•   4.2 YihE与硝酸盐还原途径
• 总结与展望
• 附录一 缓冲液及培养基配方
• 附录二 常用仪器
• 附录三 KEGG通路图
• 参考文献
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 郑松林

导师: 鲁涛

关键词: 激酶,细胞通路,活性氧

来源: 云南大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 云南大学

分类号: Q932

总页数: 67

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