坦布苏病毒体外感染模型研究

论文摘要

坦布苏病毒（Tembusu virus,TMUV）属于黄病毒科,黄病毒属。坦布苏病毒病是一种新发急性传染病,发病率高,传染性强,主要造成鸭群采食量急剧下降,产蛋量突然降低,甚至停产,给我国养禽业带来严重的经济损失。由于坦布苏病毒疫情变化快,针对该病毒的防疫产品需及时更新,所以应对坦布苏病毒Du/CH/LSD/110128株的增殖、传播、致病机制进行深入了解,但是目前并没有适用于研究该毒株的体外实验模型,所以需要建立坦布苏病毒体外感染模型。本研究首先通过RT-PCR等方法,发现坦布苏病毒Du/CH/LSD/110128株原代毒CF1能够在禽类细胞DF-1、LMH、CEF、DEF、猴类细胞Vero、人类非转化细胞系293T以及人类转化细胞系A549、HCT116中增殖,但均不引起细胞病变效应（CPE）。在鸭胚上传代之后,会引起鸭胚胚体的出血损伤。但其鸡胚传代致弱毒CF100只能够在Vero细胞中增殖,且不会引起鸭胚出血。CF1与CF100能够稳定的作为该毒株增殖机制研究的体外模型;该毒株的DEF细胞毒与CF1在鸭源细胞DEF中不存在病毒增殖的差异,但存在CPE的差异,因此可以作为该毒株在鸭源细胞上致病变效应机制的体外研究模型;DEF细胞毒同样能够在人类细胞中增殖,并能够在DEF细胞引发细胞病变。基于以上结果,本实验选取DEF细胞毒感染人类非转化细胞系293T作为体外感染模型,利用基于CRISPR/Cas9的全基因组基因功能缺失筛选技术,寻找坦布苏病毒感染人类细胞后产生病变效应的关键宿主限制性因子。生物信息学分析高通量测序结果获得276个显著下调的基因,下调基因可能是促进坦布苏病毒感染293T-GeCKO细胞后细胞死亡的基因,可能是细胞内存在的病毒感染细胞产生病变的限制因素。本研究针对这些基因进行KEGG细胞信号通路分析和GO功能注释分析,发现胰岛素分泌通路、胰高血糖素信号通路、细胞内钙激活氯通道、钙离子转运等生物学过程等可能是人类细胞抵御TMUV病变效应的重要机制。进一步针对这276个显著下调的基因开展了蛋白质-蛋白质互作网络分析,发现POLR2C可能在上述过程中发挥核心调控作用。本研究详细探究了本实验室贮存坦布苏病毒毒株与不同物种宿主的转化及非转化细胞的相互作用规律,初步确定了针对不同研究目的的坦布苏病毒体外感染模型,为坦布苏病毒致病机制的后续研究奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 英文缩略表
• 第一章 引言
•   1.1 坦布苏病毒
•     1.1.1 坦布苏病毒病概述
•     1.1.2 坦布苏病毒的病原学
•     1.1.3 坦布苏病毒的致病性
•     1.1.4 坦布苏病毒的诊断方法
•   1.2 CRISPR/CAS9 系统
•     1.2.1 CRISPR/Cas9 系统工作原理
•     1.2.2 基于CRISPR/Cas9 慢病毒包装系统人全基因组基因功能缺失筛选平台
•   1.3 本研究目的意义
• 第二章 TMUV（DU/CH/LSD/110128 株）增殖、细胞毒性及致弱模型的探索
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 病毒株和细胞系
•     2.1.2 SPF鸡胚和SPF鸭胚
•     2.1.3 主要实验试剂及仪器
•     2.1.4 其他试剂及其配制
•     2.1.5 引物序列
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 制备标准品
•     2.2.2 TMUV扩繁
•     2.2.3 TMUV毒价的测定
•     2.2.4 TMUV在细胞中的增殖检测
•     2.2.5 TMUV-鸡胚毒在鸭胚中的传代
•     2.2.6 TMUV-DEF细胞毒对细胞增殖的影响检测
•   2.3 实验结果
•     2.3.1 TMUV-鸡胚毒在不同物种细胞中的增殖情况
•     2.3.2 TMUV-鸡胚毒不能够引起细胞病变
•     2.3.3 TMUV-鸡胚毒在鸭胚中的传代
•     2.3.4 TMUV-鸡胚毒CF1与DEF细胞毒在DEF细胞中的增殖情况
•     2.3.5 TMUV-鸡胚毒CF1与DEF细胞毒对DEF细胞的致病变效应差异
•     2.3.6 TMUV-DEF细胞毒在细胞中的增殖情况
•     2.3.7 TMUV-DEF细胞毒不能够引起细胞病变
•     2.3.8 TMUV-DEF细胞毒不影响细胞的增殖
•   2.4 讨论
• 第三章 人细胞系中细胞毒性相关基因及分子网络的筛选
•   3.1 材料与仪器
•     3.1.1 主要试剂及仪器
•     3.1.2 细胞系和质粒
•     3.1.3 引物序列
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 GeCKO文库的扩增
•     3.2.2 GeCKO文库慢病毒的包装
•     3.2.3 GeCKO文库慢病毒MOI的测定
•     3.2.4 GeCKO文库慢病毒感染293T细胞
•     3.2.5 GeCKO感染293T细胞的鉴定
•     3.2.6 TMUV-DEF细胞毒感染表达CRISPR/Cas9的293T细胞
•     3.2.7 GeCKO文库的PCR建库
•   3.3 实验结果
•     3.3.1 表达CRISPR/Cas9的293T细胞g RNA鉴定
•     3.3.2 表达CRISPR/Cas9的293T细胞lentivirus vector鉴定
•     3.3.3 表达CRISPR/Cas9的293T细胞Cas9 鉴定
•     3.3.4 TMUV-DEF细胞毒感染表达CRISPR/Cas9的293T细胞
•     3.3.5 GeCKO文库的PCR建库
•     3.3.6 高通量数据pathway分析结果
•     3.3.7 高通量数据GO分析结果
•     3.3.8 高通量数据蛋白互作分析结果
•   3.4 讨论
• 第四章 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 梁雨萌

导师: 李海

关键词: 坦布苏病毒,体外感染

来源: 中国农业科学院

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 中国农业科学院

基金: “国家重点研发计划项目”(2016YFD0500107-4),中国农业科学院“青年英才计划”项目(CAASQNYC-KYYJ-56),中国农业蛋鸡体系(CARS-40-K18),国家科技支撑计划课题“禽流感等重要家禽疫病流行毒疫苗研究与开发”(2015BAD12B03),中国农业科学院科技创新工程协同创新任务(CAAS-XTCX2016011-04)

分类号: S852.65

总页数: 54

文件大小: 3008K

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