小麦F-box蛋白基因TaFBA1在ABA介导的植物干旱耐性中的功能

论文摘要

植物在生长发育中经常受到干旱胁迫的影响,加强植物耐旱机理的研究对提高植物的抗逆性和农作物的稳产、高产、优质具有重要意义。干旱胁迫下植物体内ABA水平上升,进而提高了植物抗逆性。F-box蛋白作为SCF型E3连接酶的关键亚基,在植物逆境耐性中具有重要功能,但小麦F-box蛋白与ABA调控的逆境耐性之间的关系尚不清楚。实验室前期克隆了小麦F-box蛋白基因TaFBA1。研究发现,TaFBA1过表达提高了转基因烟草的耐旱性,并且过表达TaFBA1烟草的气孔开度大,意味着TaFBA1在ABA调控的气孔关闭中起负调控作用。本文研究了TaFBA1在ABA介导的植物干旱耐性及气孔运动中的作用,并分析了其分子与生理机制。主要结果如下:（1）用基因组PCR和荧光定量PCR对TaFBA1过表达拟南芥、突变体和TaFBA1回补拟南芥进行筛选。选取过表达株系OE4、OE5、OE6,突变体atfbw2-4、atfbw2-5、atfbw2-6和回补株系R-4、R-5、R-6作为实验材料。（2）用甘露醇模拟干旱胁迫对各株系进行处理,同时添加ABA合成抑制剂Na6WO4,观察统计种子萌发、子叶转绿和幼根生长。结果显示,正常条件下各株系的这些指标无明显差异;干旱抑制了所有株系的种子萌发、子叶转绿和根系生长,但对过表达株系的抑制小于WT,对突变体的抑制大于WT;突变体中回补TaFBA1后,其干旱耐性明显提高。抑制ABA合成后,干旱处理对所有植株的抑制效应均有减轻,但没有改变各株系之间的差异。这些结果暗示TaFBA1可能没有参与ABA的合成。ABA含量检测的结果也证明了这一点。（3）对各株系的成苗进行自然干旱处理,检测植株生长和叶片光合能力。结果发现,干旱处理对成苗植株的影响与幼苗基本一致。正常条件下过表达和突变体株系的光合能力,包括气孔导度（Gs）、蒸腾速率（E）、净光合速率（Pn）、细胞间CO2浓度（Ci）都无明显差异。干旱处理后,TaFBA1过表达株系的Gs、E、Pn都高于WT,突变体则反之;Ci无明显差异。结果表明TaFBA1过表达提高了拟南芥的光合能力。（4）用ABA处理各株系发现,过表达株系的种子萌发率和子叶变绿程度高、幼根伸长快、成苗长势好;突变体植株则反之;突变体回补TaFBA1能够降低突变体对ABA的敏感性。ABA处理条件下,TaFBA1过表达株系的光合能力强于WT,更强于突变体。这些结果说明TaFBA1过表达减轻了ABA处理对拟南芥植株的抑制效应。（5）特别值得注意的是,干旱和ABA处理条件下,TaFBA1过表达植株有较高的Gs。过表达植株的气孔关闭对ABA反应比较慢,突变体的气孔关闭对ABA反应比较快。说明过表达TaFBA1导致转基因植株的气孔关闭对ABA敏感性降低。（6）为了进一步探究TaFBA1调控ABA信号通路的分子机制,我们检测了ABA信号相关基因的表达,包括ABA信号响应基因和ABA合成相关基因。结果表明TaFBA1可调控ABA信号响应基因表达,但对ABA合成相关基因影响不大。气孔运动相关基因在过表达植株中均下调。这说明TaFBA1可能通过调控ABA响应和气孔运动相关基因的表达,进而参与气孔开关的调节。（7）以TaFBA1为诱饵,通过酵母双杂实验获得了两个与TaFBA1互作的蛋白,ABA受体RCAR1和转录因子ABI5。双分子荧光互补实验（BiFC）显示TaFBA1与RCAR1能够相互作用,互作位置可能在细胞膜上。（8）从生理生化水平分析了各株系的抗氧化能力。结果表明,干旱和ABA条件下,TaFBA1过表达株系中H2O2含量、O2·ˉ产生速率以及MDA含量均低于WT,突变体则反之,回补株系均低于突变体。说明过表达TaFBA1增强了ABA和干旱处理条件下转基因拟南芥的抗氧化能力。这可能是TaFBA1提高拟南芥耐旱性的重要原因。综上所述,小麦TaFBA1正向调节植物耐旱性,但与ABA生物合成无关。TaFBA1可能通过与RCAR1和ABI5相互作用,调控ABA信号通路相关的基因表达,进而负调节拟南芥对ABA的敏感性。增加抗氧化能力和减少活性氧积累可能是TaFBA1过表达转基因植株耐旱性提高的重要机制。

论文目录

• 符号说明
• 中文摘要
• Abstract
• 1 前言
•   1.1 干旱胁迫对植物的影响
•   1.2 ABA信号通路组分
•     1.2.1 ABA受体
•     1.2.2 蛋白激酶/磷酸酶
•     1.2.3 ABA反应的基因表达调控
•   1.3 泛素-26S蛋白酶体途径
•   1.4 泛素连接酶E3的分类及结构特征
•     1.4.1 HECT型泛素连接酶
•     1.4.2 RING/U-box型泛素连接酶
•     1.4.3 APC型泛素连接酶
•     1.4.4 SCF型泛素连接酶
•   1.5 F-box蛋白的结构及其功能
•     1.5.1 F-box蛋白结构
•     1.5.2 F-box蛋白的功能
•       1.5.2.1 F-box蛋白与植物的生长发育
•       1.5.2.2 F-box蛋白在激素信号途径中的作用
•       1.5.2.3 F-box蛋白在植物响应逆境胁迫中的作用
•   1.6 本研究的目的意义
• 2 材料与方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 植物材料
•     2.1.2 材料培养与处理
•     2.1.3 菌种与质粒
•     2.1.4 酶及生化试剂
•     2.1.5 引物
•   2.2 分子生物学实验方法
•     2.2.1 转基因拟南芥的鉴定
•       2.2.1.1 CTAB微量法提取基因组DNA
•       2.2.1.2 转基因拟南芥的PCR检测
•     2.2.2 转基因拟南芥基因表达水平的检测
•       2.2.2.1 利用TRIZOL试剂盒提取RNA
•       2.2.2.2 反转录cDNA第一链的合成
•       2.2.2.3 转基因拟南芥的荧光定量PCR检测
•     2.2.3 载体构建
•       2.2.3.1 转化拟南芥和BiFC的载体构建
•       2.2.3.2 酵母双杂的载体构建
•     2.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
•       2.2.4.1 大肠杆菌感受态细胞的制备
•       2.2.4.2 大肠杆菌感受态细胞的转化
•     2.2.5 农杆菌感受态细胞的制备和转化
•       2.2.5.1 农杆菌感受态细胞的制备
•       2.2.5.2 农杆菌感受态细胞的转化
•     2.2.6 农杆菌转化拟南芥
•     2.2.7 荧光定量PCR
•     2.2.8 酵母双杂实验
•       2.2.8.1 酵母感受态制备
•       2.2.8.2 转化酵母感受态细胞
•       2.2.8.3 验证互作
•     2.2.9 农杆菌介导的烟草叶片瞬时表达
•   2.3 植物生理生化实验方法
•     2.3.1 拟南芥种子萌发率统计
•     2.3.2 拟南芥幼苗根长的统计
•     2.3.3 光合参数的测定
•     2.3.4 气孔开度测定
•     2.3.5 超氧阴离子自由基及过氧化氢含量测定
•     2.3.6 NBT染色检测
•     2.3.7 丙二醛含量的测定
•   2.4 统计分析
• 3 结果与分析
•   3.1 转基因拟南芥株系的筛选和鉴定
•   3.2 过表达TaFBA1提高了拟南芥的干旱耐性
•   3.3 TaFBA1参与调控ABA介导的拟南芥生长和光合作用
•   3.4 TaFBA1参与调控拟南芥的气孔运动
•   3.5 TaFBA1对ABA信号相关基因及气孔运动相关基因表达的影响
•   3.6 TaFBA1与ABA受体RCAR1和ABI5互作
•   3.7 TaFBA1参与调控ROS积累和抗氧化能力
• 4 讨论
•   4.1 小麦Ta FBA1正向调节拟南芥的耐旱性但不参与ABA的合成
•   4.2 小麦Ta FBA1负向调节拟南芥对ABA的敏感性
•   4.3 TaFBA1可能通过与RCAR1和ABI5 互作调控气孔运动相关基因的表达
•   4.4 减少活性氧积累以及增加抗氧化能力可能是Ta FBA1提高植物的耐旱性的重要原因
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的论文及成果

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 安洁

导师: 王玮

关键词: 小麦蛋白,信号,受体,干旱胁迫,气孔运动,抗氧化能力

来源: 山东农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 山东农业大学

基金: 国家自然科学基金(No.31370304)

分类号: Q945.78

总页数: 72

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