原型泡沫病毒利用Tas激活NF-κB信号通路且利用NF-κB因子增强病毒复制

论文摘要

泡沫病毒（Foamy virus）是泡沫病毒属（Spumavirus）的唯一成员。泡沫病毒感染宿主后,宿主会发生一定的免疫应答,但并不会出现明显的病理性损伤,而是呈现出持续性的低水平感染状态,体外感染细胞出现病变反应（Cytopathic effect,CPE）,主要是由于细胞胞浆内空泡的积累和内质网的膨胀所致。泡沫病毒的基因结构,转录调控方式和生活周期等与其他的逆转录病毒也存在很大的差异。NF-κB信号通路是免疫调控通路之一。NF-κB信号通路主要由p50（NF-κB1）,p52（NF-κB2/p100）,c-Rel（Rel）,RelA,Re1B 组成。NF-κB 家族蛋白二聚化后才能发挥其功能。NF-κB信号通路分为经典的激活途径和非经典的激活途径。活化之后的NF-κB因子发生核易位与核内相关的DNA结合诱导靶基因转录。NF-κB信号通路对于细胞凋亡、病毒复制、肿瘤发生、炎症和各种自身免疫疾病等均具有调节功能。病毒本身有一定的策略来应对NF-κB信号通路,也会利用宿主细胞的某些因子来完成或者增强自身的复制。本实验主要是分析了泡沫病毒的反式激活因子Tas能够激活宿主细胞NF-κB信号通路且可以利用NF-κB因子增强病毒复制。本论文取得实验结果如下:（1）PFV反式激活因子Tas可以激活宿主细胞NF-κB信号通路首先将实验室现有的三种不同宿主的泡沫病毒反式激活因子原核表达载体:pcDNA4-SFV-1-tas、pcDNA4-PFV-tas、pcDNA4-SFV-Ora-tas,分别与 pNFκB-TA-luc报告质粒同时瞬时转染Hela细胞,通过双荧光素酶报告系统检测3个不同种泡沫病毒的Tas对于NF-κB的激活活性。最后发现PFV反式激活因子Tas对于NF-κB激活活性更加明显;比较PFV中两种反式激活因子Bet和Tas对NF-κB激活活性。进一步验证PFV反式激活因子Tas能够激活宿主细胞NF-κB信号通路。结果分析表明:病毒的反式激活因子Tas能够激活宿主细胞NF-κB信号通路。（2）检测NF-κB信号通路相关蛋白在Tas诱导表达细胞系Hela PLVX-TRE3G-ZSGreen-Tas中诱导表达Tas蛋白,48小时后,检测NF-κB信号通路相关基因在Tas蛋白稳定表达情况下转录水平和蛋白水平的变化;所以Tas表达48小时后通过Western Blot检测核内的RelA,RelB蛋白的表达变化,同时通过检测总蛋白中的RelA,RelB蛋白,发现RelB总体表达水平上调,所以Tas会促进RelB的表达。另一方面我们也通过免疫荧光实验直观的检测RelA,P100是否在Tas的作用下发生了进核反应。最终发现通过免疫荧光实验和Western Blot变化证明了 Tas能够通过经典的,非经典途径激活NF-κB信号通路。且Tas能够促进非经典途径中的RelB表达上调。（3）通过将IκBα磷酸化位点突变,阻断经典NF-κB活化途径前面的实验我们发现Tas能够通过经典的、非经典途径激活NF-κB信号通路,两条途径组成因子不同,所以为了明确其主要是先激活了哪一条途径,将IκBα的ser32和ser36突变为Ala阻断其磷酸化,进而阻断了经典的NF-κB途径活化,检测这种情况下非经典途径相关蛋白的变化。虽然有文献报道称经典的NF-κB途径可能会抑制非经典的NF-κB途径上的信号传导,但是阻断经典途径之后,对于非经典途径似乎是没有影响的。（4）Tas与NF-κB信号通路RelB—同促进病毒复制Tas能够促进RelB的转录,同时进一步我们发现RelB和Tas共同作用能够促进病毒LTR的转录:通过双荧光素酶报告基因系统检测RelA,RelB对LTR的影响。结果分析表明相比较RelA,RelB增强了 Tas的反式激活活性且这种增强呈剂量依赖的方式。如果通过p100将RelB隔离在细胞质中,发现RelB增强Tas诱导的LTR转录的作用减弱。这些数据说明RelB与Tas共同作用能促进病毒复制。综上所述发现原型泡沫病毒利用其反式激活因子Tas激活细胞的NF-κB信号通路。本研究阐明了原型泡沫病毒与NF-κB信号通路之间的相互关系,为后续其潜伏性感染机制深层次研究提供一定的理论依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 符号、标志缩略词注释说明表
• 第一章 绪论
•   1.1 泡沫病毒的概论
•     1.1.1 泡沫病毒的分类及形态特征
•     1.1.2 泡沫病毒的基因结构及基因表达调控
•     1.1.3 泡沫病毒的复制
•     1.1.4 泡沫病毒载体
•   1.2 细胞NF-κB信号通路及其与病毒的关系概述
•     1.2.1 NF-κB信号通路
•   1.3 研究意义、展望
•   1.4 技术路线图
• 第二章 原型泡沫病毒反式激活因子Tas可以激活NF-κB信号通路
•   2.1 引言
•   2.2 实验材料、仪器设备
•     2.2.1 实验材料
•     2.2.2 仪器设备
•   2.3 实验方法与步骤
•     2.3.1 细胞复苏,传代以及冻存
•     2.3.2 细胞转染以及荧光素酶活性检测
•   2.4 实验结果
•     2.4.1 无内毒素质粒的制备
•     2.4.2 不同泡沫病毒的反式激活因子Tas对宿主NF-κB启动子活性的影响
•     2.4.3 PFV的反式激活因子Tas对NF-κB启动子活性的影响
•   2.5 讨论
• 第三章 PFV反式激活因子Tas即能激活NF-κB经典途径也能够激活非经典途径
•   3.1 前言
•   3.2 实验材料、仪器设备
•     3.2.1 实验材料
•     3.2.2 仪器设备
•   3.3 实验方法与步骤
•     3.3.1 引物的设计和合成
•     3.3.2 构建表达载体pcDNA6-p100-HisA、pcDNA-RelA-HisA
•     3.3.3 细胞复苏,传代及冻存
•     3.3.4 细胞转染
•     3.3.5 RNA的提取及定量
•     3.3.6 逆转录PCR
•     3.3.7 RelB、RelA核算水平变化检测
•     3.3.8 免疫荧光实验
•   3.4 实验结果
•     3.4.1 表达载体pcDNA6-p100-HisA、pcDNA6-RelA-HisA的构建
•     3.4.2 NF-κB相关基因实时定量PCR、Western Blot检测结果
•     3.4.3 Western Blot检测细胞核内NF-κB相关因子变化
•     3.4.4 免疫荧光实验结果
•   3.5 讨论
• 第四章 阻断经典途径对Tas通过非经典途径激活NF-κB信号通路无影响
•   4.1 前言
•   4.2 实验材料、仪器设备
•     4.2.1 实验材料
•     4.2.2 仪器设备
•   4.3 实验方法和步骤
•     4.3.1 引物的设计和合成
•     4.3.2 构建突变载体pcDH-CMV-IκBα （AA）-pro
•     4.3.3 细胞的复苏,传代和冻存
•     4.3.4 构建pcDH-CMV-IκBα（AA）-pro稳定表达细胞系
•     4.3.5 检测pcDH-CMV-IκBα（AA）-pro细胞系中RelA,RelB蛋白的表达
•   4.4 实验结果
•     4.4.1 无内毒素质粒的制备
•     4.4.2 表达载体pcDH-CMV-IκBα-pro的构建
•     4.4.3 检测pcDH-CMV-IκBα（AA）-pro细胞系中RelB的表达
•   4.5 讨论
• 第五章 RelB与PFV Tas共同作用增强病毒复制
•   5.1 前言
•   5.2 实验材料、仪器设备
•     5.2.1 实验材料
•     5.2.2 仪器设备
•   5.3 实验方法与步骤
•     5.3.1 引物的设计和合成
•     5.3.2 构建表达载体pcDNA6-RelB-HisA
•     5.3.3 细胞复苏、传代及冻存
•     5.3.4 细胞转染以及荧光素酶活性检测
•   5.4 实验结果
•     5.4.1 无内毒素质粒的制备
•     5.4.2 表达载体pcDNA-RelB-HisA的构建
•     5.4.3 过表达RelB/RelA蛋白对泡沫病毒LTR启动子活性的影响
•     5.4.4 Tas与RelB共同作用促进病毒复制
•   5.5 讨论
• 第六章 总结与展望
•   6.1 总结
•   6.2 展望
• 参考文献
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王雪敏

导师: 李治

关键词: 原型泡沫病毒,反式激活因子,经典的激活途径,非经典的激活途径

来源: 陕西师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 陕西师范大学

分类号: R373

DOI: 10.27292/d.cnki.gsxfu.2019.001227

总页数: 82

文件大小: 4349K

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