紫花苜蓿与蒺藜苜蓿耐盐/碱miRNA的筛选和功能鉴定

论文摘要

盐碱胁迫是全世界普遍存在的一种非生物胁迫,盐碱化土壤中的植物生长和生理功能会受到这种环境因素的影响,这是导致农作物减产的主要环境因素之一。而当前世界范围内日益减少的可耕种土地以及增长的粮食需求都对农作物的育种工作提出了重要挑战。紫花苜蓿是一种重要的豆科牧草植物,因其高产量、营养丰富、高蛋白含量、较好的适口性而享有“牧草之王”的美称。此外,紫花苜蓿还可以对土壤的生态环境进行改良,使其同时兼具重要的经济和生态价值。迄今为止,已在植物中发现多个参与盐胁迫逆境调控的基因,这些基因对增强植物的耐盐性具有重要意义。而近年来研究发现有关非编码RNA尤其是miRNA在植物的多种抗逆过程中也扮演了重要角色,许多miRNA都可以影响植物的盐/碱耐受性。与紫花苜蓿相比,蒺藜苜蓿是一种重要的豆科模式植物,为研究紫花苜蓿以及其他豆科植物遗传发育提供了理论基础和参考作用。为了研究紫花苜蓿“中苜一号”（Medicago sativa cv.Zhongmu-1）和蒺藜苜蓿“R108”（Medicago truncatula）在盐/碱胁迫下应激反应机理,本研究将两种苜蓿的种子浸泡在混合盐/碱溶液中,通过sRNA测序技术对两种苜蓿发芽阶段的miRNA表达进行差异分析。在两种苜蓿材料中鉴定出了156个家族的685种已知miRNA以及221新型miRNA,并在蒺藜苜蓿中分析出81种miRNA在盐处理时存在差异表达,129种miRNA在碱处理时存在差异表达;紫花苜蓿中鉴定了24种盐胁迫响应miRNA和72种碱胁迫响应miRNA。分析表明这些差异表达miRNA的靶标基因功能分布较广,其中许多靶标基因可能参与盐胁迫应激调控作用,这为植物特别是苜蓿的转录后水平耐盐调控机理提供了新的证据和研究方向。为进一步研究苜蓿的耐盐机理,我们挑选了三种可能参与苜蓿盐/碱胁迫调控的miRNA即mtr-miR319,mtr-miR395和mtr-miR1510b作为进一步研究对象。通过在拟南芥和蒺藜苜蓿中超表达3种miRNA来进行相关的耐盐性研究。和野生型拟南芥哥伦比亚型相比,三种miRNA转基因苗均没有表现出更高的发芽率,但是Mtr-miR319转基因拟南芥在盐处理时其抽薹开花的时间受到了抑制,并且其对盐胁迫的抗性可能与mtr-miR319的表达水平有关。而Mtr-miR395转基因拟南芥则表现出耐盐性增强的结果,在盐处理时其叶片保水能力更强。另外通过5’RACE技术和烟草叶片瞬时基因表达的方式验证了苜蓿中mtr-miR319和mtr-miR395的靶基因。

论文目录

• 摘要
• 英文摘要
• 英文缩略词对照表
• 1 绪论
•   1.1 土壤盐渍化的现状
•     1.1.1 土壤盐渍化对植物和农作物生产的危害
•     1.1.2 碱性土壤的危害和研究现状
•   1.2 紫花苜蓿耐盐性研究进展
•     1.2.1 紫花苜蓿与蒺藜苜蓿介绍
•     1.2.2 紫花苜蓿和蒺藜苜蓿耐盐性育种研究进展
•     1.2.3 紫花苜蓿的生态价值
•   1.3 植物miRNA的概述
•     1.3.1 植物miRNA的合成以及作用方式
•     1.3.2 miRNA参与植物胁迫中的作用
•     1.3.3 miR319 的研究现状
•     1.3.4 miR395 研究现状
•     1.3.5 miR1510 研究现状
•   1.4 研究的意义和目的
• 2 蒺藜苜蓿和紫花苜蓿中盐/碱胁迫响应miRNA的筛选
•   2.1 引言
•   2.2 实验材料
•     2.2.1 植物材料
•     2.2.2 实验仪器
•     2.2.3 实验试剂
•     2.2.4 实验用部分溶液及其配制方法
•     2.2.5 分析软件与网址
•   2.3 实验方法与步骤
•     2.3.1 植物的处理与培养
•     2.3.2 Trizol法提取植物组织总RNA
•     2.3.3 PloyA加尾法反转录miRNA
•     2.3.4 miRNA与预测靶基因的荧光定量检测
•     2.3.5 sRNA测序
•     2.3.6 测序数据处理分析
•     2.3.7 miRNA靶标基因预测
•   2.4 实验结果
•     2.4.1 盐/碱处理对紫花苜蓿和蒺藜苜蓿的发育影响
•     2.4.2 盐/碱处理后测序结果分析
•     2.4.3 盐/碱处理后差异表达的miRNA分析
•     2.4.4 盐/碱处理后差异表达的miRNA的靶基因功能和信号通路富集分析
•     2.4.5 RT-qPCR验证miRNA和预测靶基因的表达
•     2.4.6 讨论
•   2.5 小结
• 3 miRNA的克隆与转化
•   3.1 材料
•     3.1.1 生物材料
•     3.1.2 生物试剂
•     3.1.3 其他材料
•     3.1.4 实验仪器
•     3.1.5 培养基以及相关配方
•   3.2 方法
•     3.2.1 植物的培养
•     3.2.2 蒺藜苜蓿基因组提取
•     3.2.3 mtr-mi R319,mtr-mi R395和mtr-mi R1510b前体的克隆
•     3.2.4 表达载体pCAMBIA3301 的线性化
•     3.2.5 超表达载体的重组反应
•     3.2.6 感受态农杆菌的转化
•     3.2.7 菌液PCR
•     3.2.8 转基因拟南芥获取
•     3.2.9 蒺藜苜蓿的转基因
•     3.2.10 转基因拟南芥和蒺藜苜蓿的阳性率鉴定
•   3.3 结果分析
•     3.3.1 超表达载体的构建
•     3.3.2 miRNA超表达拟南芥的阳性鉴定以及表达量鉴定
•     3.3.3 miRNA超表达蒺藜苜蓿的阳性鉴定
•     3.3.4 讨论
•   3.4 本章小结
• 4 转基因植物的耐盐性鉴定
•   4.1 材料
•     4.1.1 生物材料
•     4.1.2 生物试剂
•     4.1.3 实验仪器
•   4.2 方法
•     4.2.1 拟南芥叶片的相对含水量测定
•     4.2.2 拟南芥叶片脯氨酸的测定
•   4.3 结果
•     4.3.1 盐处理对三种miRNA转基因拟南芥的发芽影响
•     4.3.2 盐处理以及生理指标测定
•   4.4 讨论
•   4.5 本章小结
• 5 miR319 以及miR395 的靶基因鉴定
•   5.1 材料
•     5.1.1 生物材料
•     5.1.2 生物试剂
•   5.2 方法
•     5.2.1 5’RLM-RACE
•     5.2.2 miRNA对靶基因表达蛋白的抑制作用
•     5.2.3 Western-blot检测
•     5.2.4 统计学分析
•   5.3 结果
•     5.3.1 miR319和mi R395 作用于TCP4和ATPS1的m RNA
•     5.3.2 miR319和mi R395 作用于TCP4和ATPS1 的蛋白翻译过程
•   5.4 讨论
•   5.5 本章小结
• 6 全文总结
•   6.1 结论
•   6.2 后续工作及展望
• 参考文献
• 附录
•   A 作者在攻读硕士学位期间所发表的文章目录
•   B 学位论文数据集
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 曹春雨

导师: 王凭青

关键词: 紫花苜蓿,蒺藜苜蓿,盐胁迫,高通量测序

来源: 重庆大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 重庆大学

分类号: Q943.2

DOI: 10.27670/d.cnki.gcqdu.2019.000321

总页数: 88

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