转录因子Eha直接调控迟缓爱德华菌的靶基因

论文摘要

目的 Eha是一种重要转录调控因子,它可以影响迟缓爱德华氏菌（Et）的胞内存活,本实验探究Eha直接调控的靶基因如何抵御巨噬细胞杀灭细菌的分子机制。方法构建pGEX-4T-ehaflag重组质粒,电击导入eha基因缺失株的ET-13菌,得到Cehaflag ET13重组菌;用Western blot检测重组菌Eha-Flag融合蛋白的表达,并用细菌胞内存活实验检测细菌EhaFlag融合蛋白的活性;我们釆用染色质免疫共沉淀（CHIP）技术,用抗Flag标签抗体对靶基因沉淀Eha-DNA片段,除去结合的蛋白并纯化DNA片段;以RNA-Sequencing的差异表达基因设计引物,以CHIP得到的DNA样品为模板,进行qRT-PCR; PCR扩增靶基因的启动子区域,构建了pBAD-P靶lac Z重组质粒,电击分别导入ET-13野生株和eha基因缺失株,比较它们β-半乳糖苷酶活性的差异;SDS-PAGE电泳比较野生株和缺失株外膜蛋白、厌氧C4二羧酸转运蛋白DcuA1和鞭毛钩蛋白FlgK表达的差异,并用细菌胞内存活实验比较野生株和缺失株的差异。结果 Western blot表明,Cehaflag ET13重组菌能够表达Eha-Flag融合蛋白;细菌胞内存活实验表明,该融合蛋白完全可以恢复缺失株在胞内降低的生存能力,Flag融合标签不影响Eha蛋白的功能;通过qPCR鉴定CHIP,富集到Eha的结合靶点,最终筛选出10个Eha直接结合的基因;通过野生株和缺失株中β-半乳糖苷酶活性的差异,证明eha基因对5个靶基因启动子有直接调控作用;通过检测野生株和缺失株表型的差异,证明eha基因对靶蛋白DcuA1,TnaA和FlgK的表达和活性有调控作用。结论 Eha可以通过直接调控这些靶基因,使Et菌在巨噬细胞内的存活受到影响。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1 Et 株
•   1.2 重组质粒
•   1.3 细菌EhaFlag融合蛋白的表达
•   1.4 细菌的胞内生存实验研究
•   1.5 染色质免疫共沉淀
•     1.5.1 细菌的固定
•     1.5.2 超声处理
•     1.5.3 除杂与抗体孵育
•     1.5.4 免疫复合物的沉淀与洗涤, 解交联
•     1.5.5 荧光定量PCR （quantitative real time PCR, qRT-PCR）
•   1.6 构建靶基因启动子和LacZ融合质粒及检测β-半乳糖苷酶
•   1.7 SDS-PAGE检测细菌外膜蛋白表达
•   1.8 SDS-PAGE检测细菌鞭毛蛋白表达
•   1.9 统计学分析
• 2 结 果
•   2.1 细菌EhaFlag融合蛋白的表达
•   2.2 细菌EhaFlag融合蛋白活性的检测
•   2.3 染色质免疫共沉淀超声条件的摸索
•   2.4 寻找Eha蛋白直接结合的基因
•   2.5 检测eha基因对靶基因启动子直接调控作用
•   2.6 比较野生株和eha基因缺失株外膜蛋白表达的差异
•   2.7 比较野生株和eha基因缺失株鞭毛蛋白表达的差异
•   2.8 eha基因调控tnaA基因影响Et菌胞内生存的作用
• 3 讨 论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 田畅,刘念,郑恩金,高大庆,陆承平

关键词: 迟缓爱德华氏菌,转录调控因子,基因

来源: 中国人兽共患病学报 2019年04期

年度: 2019

分类: 医药卫生科技,基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学,水产和渔业

单位: 东南大学医学院,南京农业大学动物医学院

基金: 国家自然科学基金项目(No.31570124)资助~~

分类号: S852.61;S941.42

页码: 299-310

总页数: 12

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