鸭坦布苏病毒流行株prM蛋白单克隆抗体的制备及其抗体依赖性感染增强作用的初步验证

论文摘要

鸭坦布苏病毒病是由坦布苏病毒（Tembusu Virus,TMUV）引起的一种新发传染性疾病。该病自2010年起持续危害我国水禽养殖业,造成了严重经济损失。2017年11月,山东临沂地区一前期接种过鸭坦布苏病毒弱毒疫苗的种鸭群发生以产蛋下降为主要特征的疾病。通过采集脑、肝脏等组织制备组织悬液,无菌处理后在10日龄鸭胚上盲传四代,经鉴定,本试验获得了一株鸭坦布苏病毒,随后进行了动物回归试验。所收获毒液对易感雏鸭进行了致病性试验。结果显示,该分离株可致胚体出血、侏儒化,攻毒死亡雏鸭剖检可见肺脏、脑膜出血水肿,腺胃出血,脾脏肿大、表面有出血点等病变,与临床病例表现一致。对该毒株NS1基因和prM基因进行遗传进化分析,结果表明该分离株位于中国基因II型分支上,且与该分支上的其他参考株同源性较高,氨基酸同源性最高可达99.4%,核苷酸的同源性最高达99.8%。综上所述,本研究成功从免疫鸭群中分离到一株有致病性的鸭坦布苏病毒病野毒株。从分离到的鸭坦布苏病毒中扩增出prM基因,成功构建了pET-32a-prM原核表达载体,将其转入大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,并对表达出的鸭坦布苏病毒prM蛋白进行纯化。利用纯化的prM蛋白作为抗原免疫3月龄新西兰白兔,获取相应的多克隆抗体。通过间接ELISA试验检测抗体效价为1:51200,Western-blot结果显示,该多克隆抗体能与pET-32a-prM重组蛋白发生特异性结合,证明其具有良好的反应性,间接免疫荧光试验结果表明制备的prM蛋白多克隆抗体可以特异性的识别TMUV感染细胞中的相应蛋白。将纯化的prM重组蛋白作为抗原免疫68周龄BALB/c小鼠,经过细胞融合和间接ELISA筛选,最终得到3株能稳定分泌prM蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并通过抗体亚类试剂盒测定所获得的单抗均为IgG1亚型。利用间接ELISA方法进行效价测定,三株单抗的细胞上清效价均在1:26以上,诱导产生腹水的效价均大于1:25600。Western-blot和间接免疫荧光试验结果表明,三株单抗均可与prM蛋白发生特异性反应。该鸭坦布苏病毒prM蛋白单克隆抗体的制备为后续研究其ADE作用机制提供了必要基础。黄病毒属病毒被认为普遍存在抗体依赖性感染增强作用（Antibody-dependent enhancement,ADE）,TMUV作为黄病毒属成员之一,其ADE的作用机制一直未能明确,而prM蛋白诱导产生的抗体被认为与黄病毒的ADE作用密切相关。本试验利用不同稀释度的抗体与鸭坦布苏病毒结合形成抗体病毒混合物后感染HEK-293细胞,通过荧光定量PCR检测鸭坦布苏病毒在细胞内的增殖情况。结果显示稀释度为1:800的抗体与鸭坦布苏病毒结合共同感染的HEK-293细胞病毒载量最高,感染效果显著增强,表明抗体依赖性感染增强作用的强度与抗体的浓度有一定关系。本研究利用制备的prM蛋白单克隆抗体通过体外试验初步探索了鸭坦布苏病毒的抗体依赖性感染增强作用,为后续研究ADE的作用机制、研发减弱特异性prM抗体的新型TMUV疫苗打下了一定基础。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
•   1.1 鸭坦布苏病毒病的病原学
•     1.1.1 鸭坦布苏病毒的形态结构及分类
•     1.1.2 鸭坦布苏病毒的理化特性
•     1.1.3 鸭坦布苏病毒的培养特性
•     1.1.4 鸭坦布苏病毒基因组的分子生物学特征
•   1.2 多克隆抗体与单克隆抗体研究现状
•     1.2.1 多克隆抗体
•     1.2.2 单克隆抗体
•   1.3 抗体依赖性感染增强作用研究进展
•   1.4 本研究的目的与意义
• 2 材料与方法
•   2.1 材料
•     2.1.1 毒株、载体、细胞及实验动物
•     2.1.2 主要试剂
•     2.1.3 主要仪器设备
•     2.1.4 主要溶液的配制
•   2.2 方法
•     2.2.1 鸭坦布苏病毒流行株的分离与鉴定
•     2.2.2 重组prM蛋白的原核表达与鉴定
•     2.2.3 重组prM蛋白多克隆抗体的制备与鉴定
•     2.2.4 重组prM蛋白单克隆抗体的制备与鉴定
•     2.2.5 鸭坦布苏病毒ADE作用的初步验证
• 3 结果
•   3.1 病毒的分离鉴定
•     3.1.1 病鸭的临床症状及剖检变化
•     3.1.2 感染鸭胚胚体病理变化
•     3.1.3 病毒尿囊液PCR检测
•     3.1.4 重组质粒菌液PCR检测
•     3.1.5 病毒NS1 基因与prM基因序列分析
•     3.1.6 病毒分离株半数致死量的测定
•     3.1.7 动物回归试验
•   3.2 重组prM蛋白的原核表达与鉴定
•     3.2.1 重组质粒pET-32a-prM的构建和双酶切验证
•     3.2.2 诱导温度的优化
•     3.2.3 诱导时间的优化
•     3.2.4 IPTG浓度的优化
•     3.2.5 重组prM蛋白纯化
•     3.2.6 重组prM蛋白浓度的测定
•     3.2.7 重组prM蛋白的Western-blot鉴定
•   3.3 重组prM蛋白多克隆抗体的鉴定
•     3.3.1 多克隆抗体效价的测定
•     3.3.2 多克隆抗体与prM重组蛋白反应性检测
•     3.3.3 间接免疫荧光检测
•   3.4 重组prM蛋白单克隆抗体的制备与鉴定
•     3.4.1 免疫小鼠血清抗体效价
•     3.4.2 杂交瘤细胞株的建立
•     3.4.3 单克隆抗体的亚类鉴定与效价测定
•     3.4.4 单克隆抗体特异性鉴定
•     3.4.5 单克隆抗体与prM重组蛋白反应性检测
•     3.4.6 间接免疫荧光检测
•     3.4.7 腹水的纯化
•   3.5 鸭坦布苏病毒ADE作用的初步验证
•     3.5.1 病毒毒力（TCID50）的测定
•     3.5.2 实时荧光定量PCR检测
• 4 讨论
•   4.1 鸭坦布苏病毒的分离鉴定
•   4.2 重组prM蛋白的原核表达
•   4.3 鸭坦布苏病毒重组prM蛋白多克隆抗体的制备与鉴定
•   4.4 鸭坦布苏病毒重组prM蛋白单克隆抗体的制备与鉴定
•   4.5 鸭坦布苏病毒抗体依赖性感染增强作用的初步验证
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文情况

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 尹丹

导师: 胡敬东

关键词: 鸭坦布苏病毒,蛋白,单克隆抗体,抗体依赖性感染增强

来源: 山东农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 山东农业大学

分类号: S852.65

总页数: 74

文件大小: 3562K

下载量: 92