miR-17-92家族对骨骼肌成肌细胞分化调节机制的研究

论文摘要

骨骼肌是维持机体运动的重要器官,也是生物体含量最多的组织,在人类中占据了40%的含量。骨骼肌容易受到损伤,已知的外界因素如:低温、穿刺、电感、过度运动;或疾病因素如:肌萎缩症、神经性病变等都会对骨骼肌造成损伤。如果不及时进行修复,则会造成运动障碍、肌肉大量缺失甚至死亡等严重结果。肌肉星型细胞（satellite cell）的存在使得骨骼肌具有自我修复的能力,星型细胞经过自我扩增后经历成肌分化、融合形成新生的肌肉纤维。有研究表明microRNAs在成肌分化中起到了关键的作用。MicroRNA-17-92家族是一群高度保守,功能繁复的非编码RNAs,其功能涉及到肿瘤发生、迁移、毒性作用等各个方面。近年来,有研究表明miR-17-92家族参与肌肉成肌分化过程,然而,其各个家族成员在该过程中的具体作用及相关机制尚不明确。本研究通过对 C2C12 细胞和 MDSCs（primary bovine skeletal muscle-drived satellite cells）细胞处理miR-17-92家族不同microRNAs来探究它们在成肌分化中的调节作用及相关机制,具体结论如下:1、miR-17和miR-20a促进C2C12和MDSCs细胞成肌分化。对培养的C2C12和MDSCs细胞转染人工合成的miR-17-92家族成员microRNA mimics,在分化条件（DM）和增殖条件（GM）下,探究了各成员对成肌分化的影响。结果证实miR-17和miR-20a显著促进两种细胞分化,而miR-18a、miR-19和miR-92a对分化无显著影响。此外,miR-18a抑制剂能够促进细胞成肌分化。2、miR-17和miR-20a是通过经典的RISC沉默复合体途径促进成肌分化。利用人工合成的siRNAs干涉AGO2和GW182两个RISC的关键蛋白,并在GM的条件下进行成肌分化实验,免疫染色结果表明,在转染miR-17和miR-20a的同时转染siAGO2和siGW182能够显著性抑制分化效果,MYHC蛋白的表达量降低。但单独的miR-17和miR-20a仍能促进分化,结果表明,miR-17和miR-20a是通过经典的microRNA-RISC沉默复合体途径来促进成肌分化的。3、miR-17和miR-20a的靶基因筛选及验证。利用RNA-seq测序技术结合生物信息分析筛选出Ccnd2、Jak1和Rhoc为miR-17和miR-20a下游的靶基因,并通过实时定量检测、Western Blot和双荧光素酶报告系统确定了靶基因的真实、可靠性。进而在GM和DM条件下验证了靶基因对C2C12细胞促进分化的效果。结果表明,在DM条件下siCcnd2、siJak1和siRhoc都能促进成肌分化,GM条件下siCcnd2、siJak1有促进作用,而siRhoc作用不显著。4、miR-19抑制miR-17的致死效应,并且miR-17+19组合进一步促进成肌分化。MiR-17在促进成肌分化的同时造成了致死效应,但miR-19的添加抑制了 miR-17造成的细胞死亡。通过转录组测序,发现miR-19能够靶向抑制Pten、Socs3和Tnfaip3,激活AKT和ERK信号通路抑制凋亡。同时,通过转录组比对、MYHC免疫染色等试验发现,miR-19和miR-17的组合进一步的促进了 C2C12的成肌分化作用。并且促进了肌细胞形成肌管。5、miR-17+19促进了小鼠胫前肌损伤修复进程。将人工设计的shRNA-17和shRNA-19的组合进行病毒包被,超速离心浓缩后注射进提前用Bacl2处理的小鼠胫前肌中,分别在第0、1、3、5、10天取出肌肉组织进行HE和免疫染色。结果表明,相比于空白对照组,microRNAs处理组形成了数目更多、横截面积更大的新生肌纤维,shRNA-17+19显著地促进了肌肉损伤修复的进程。综上所述,本论文探讨了 miR-17-92家族成员对成肌分化的调节作用,筛选出了miR-17+19的最佳促分化组合。同时验证了 miR-17促进分化以及miR-19促进存活的靶基因机制,并进一步探索了 miR-17+19促进肌肉损伤修复的能力,对肌肉损伤、肌萎缩等疾病提供了新的治疗策略。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 中英文缩写对照表
• 1 绪论
•   1.1 骨骼肌发育、损伤修复及信号调控
•     1.1.1 骨骼肌的组成及结构
•     1.1.2 脊椎动物骨骼肌的发育模式
•     1.1.3 信号通路及转录因子（MRFs）在骨骼肌发育中的调控简介
•     1.1.4 早期肌节形成中MRFs调控机制
•     1.1.5 肌肉发育中MRFs相互作用网络
•     1.1.6 骨骼肌的损伤修复简介
•     1.1.7 骨骼肌修复的形态特征
•     1.1.8 肌肉星形细胞参与损伤修复
•     1.1.9 MRFs激活骨骼肌星形细胞促进损伤修复
•     1.1.10 体外成肌细胞系的建立
•   1.2 microRNAs对成肌分化的调控作用及功能简介
•     1.2.1 microRNAs在成肌分化中的表达模式
•     1.2.2 miR-206
•     1.2.3 miR-1
•     1.2.4 miR-133
•     1.2.5 Non-myomiRs
•   1.3 microRNA-17-92家族对骨骼肌的调控作用
•     1.3.1 microRNA-17-92家族成员
•     1.3.2 microRNA-17-92家族对肿瘤的调控
•     1.3.3 microRNA-17-92家族成员在成肌分化中的调控
•   1.4 本研究的目的意义
•   1.5 本研究的创新点及后续研究设想
• 2 microRNA-17-92家族成员对C2C12细胞的分化作用
•   2.1 引言
•   2.2 材料与试剂
•     2.2.1 实验材料
•     2.2.2 实验试剂
•     2.2.3 实验器材
•   2.3 实验方法
•   2.4 结果与分析
•     2.4.1 miR-17-92在分化条件下对C2C12分化的调控作用
•     2.4.2 miR-17和miR-20a在增殖条件下促进C2C12分化
•     2.4.3 miR-17和miR-20a促进MDSCs细胞成肌分化
•     2.4.4 miR-17-92在成肌分化中的表达模式
•   2.5 讨论
•   2.6 本章小结
• 3 miR-17和miR-20a的作用机制及对转录组的改变
•   3.1 引言
•   3.2 材料与试剂
•     3.2.1 实验材料
•     3.2.2 实验试剂
•   3.3 实验方法
•   3.4 结果与分析
•     3.4.1 miR-17和miR-20a通过经典RISC-miRNA干涉模式促进C2C12分化
•     3.4.2 miR-17和miR-20a对C2C12转录组的改变
•   3.5 讨论
•   3.6 本章小结
• 4 miR-17直接靶向Ccnd2、Jak1、Rhoc促进C2C12细胞分化
•   4.1 引言
•   4.2 材料与试剂
•   4.3 实验方法
•   4.4 结果与分析
•     4.4.1 双荧光素酶报告体系验证miR-17的靶基因
•     4.4.2 miR-17下调靶基因的mRNA及蛋白表达水平
•     4.4.3 干涉靶基因促进C2C12成肌分化
•   4.5 讨论
•   4.6 本章小结
• 5 miR-17和miR-19协同促进C2C12成肌分化
•   5.1 引言
•   5.2 材料与试剂
•   5.3 实验方法
•   5.4 结果与分析
•     5.4.1 miR-19抑制miR-17在C2C12成肌分化中的致死效应
•     5.4.2 miR-19促进C2C12存活机制的探究
•     5.4.3 miR-17+19更好的促进C2C12成肌分化
•   5.5 讨论
•   5.6 本章小结
• 6 miR-17+19促进小限肌肉损伤修复
•   6.1 引言
•   6.2 材料与试剂
•   6.3 实验方法
•   6.4 结果与分析
•     6.4.1 miR-17+19促进MDSCs细胞成肌分化
•     6.4.2 shR-17+19促进小鼠肌肉损伤修复
•   6.5 讨论
•   6.6 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢

文章来源

类型: 博士论文

作者: 孔德麟

导师: 滕春波

关键词: 骨骼肌,成肌分化,损伤修复

来源: 东北林业大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 东北林业大学

基金: 国家自然科学基金(31472159和31272520),中央高校基金(2572016EAJ3)

分类号: Q952

DOI: 10.27009/d.cnki.gdblu.2019.000875

总页数: 103

文件大小: 9550k

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