新型重组乳酸杆菌递送系统的构建及其在金葡菌黏膜疫苗中的应用

论文摘要

乳酸杆菌（Lactobacillus）是一种革兰氏阳性菌,被广泛应用于食品、药品等工业。乳酸杆菌不仅安全无毒,还具有多种益生效果,也被证明可以作为活菌载体递送抗原。由于乳酸杆菌种类较多,且生化生理特性、分子构成及免疫特性均不同,种间转录和翻译的差异也很大,因此其递呈抗原的能力不同,不同菌株对同一抗原的表达水平和表达产物不同,对动物产生的抗体水平以及刺激淋巴细胞表达不同细胞因子也有差别。虽然乳酸杆菌作为活菌载体有诸多优点,但是其基因工程发展较慢,其作为受体菌依旧有许多难题需要攻克。金黄色葡萄球菌（S.aureus）是一种分布广泛的人畜共患病原菌,能引发菌血症、感染性心内膜炎等多种疾病。近年来,由于抗生素的滥用,耐药菌株逐年增加,呈现多重耐药趋势,这导致S.aureus的预防和治疗难度增大。目前,尚无有效的S.aureus疫苗问世。S.aureus通过黏膜感染机体,且尚未有关于S.aureus黏膜疫苗的报道。在本研究中,首先从本实验室的菌库中筛选获得3株野生型乳杆菌作为受体菌株,分别是开菲尔乳杆菌SXJ29、干酪乳杆菌SXJ30、植物乳杆菌WXD234。以egfp作为报告基因,构建了不同的重组乳酸杆菌SXJ29/SXJ30/WXD234（pNZ8148-egfp）,通过Western blot和激光共聚焦检测,证明外源基因egfp可以在3株野生型乳酸杆菌成功表达。3株重组乳酸杆菌与野生菌株相比,生理特性无明显变化,依旧有耐酸耐胆盐特性,外源质粒也能稳定遗传。证明了基于开菲尔乳杆菌SXJ29、干酪乳杆菌SXJ30和植物乳杆菌WXD234为载体的乳酸杆菌递送系统的可行性。该乳酸杆菌递送系统能成功表达S.aureus抗原铁-异羟肟酸摄取蛋白D2（FhuD2）和无毒突变的ɑ-溶血素(Hla H35L)。以重组乳酸菌口服免疫小鼠后,在S.aureus引发的肺炎感染模型中能为小鼠提供不同程度的保护。其中免疫重组菌WXD234(pNZ8148-hlaH35L)的保护效果最好,该重组菌能在S.aureus引发的肺炎模型中提高小鼠的存活率,一定程度缓解肺部感染程度,减少S.aureus在肺部的定植。本研究建立了基于开菲尔乳杆菌SXJ29、干酪乳杆菌SXJ30和植物乳杆菌WXD234为载体的乳酸杆菌表达系统,该表达系统能递送S.aureus抗原并对S.aureus肺部感染提供一定的免疫保护效果,为乳酸杆菌表达外源抗原以及S.aureus黏膜疫苗的开发提供了新思路和理论指导。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 第一章 文献综述
•   1.1 乳酸菌作为递送载体的研究进展
•     1.2.1 乳酸菌概述
•     1.2.2 黏膜免疫概述
•     1.2.3 乳酸菌递送载体研究现状
•   1.2 金黄色葡萄球菌概述
•     1.1.1 荚膜多糖
•     1.1.2 表面粘附分子
•     1.1.3 毒力因子
•   1.3 本课题的研究意义
• 第二章 乳酸杆菌递送系统的建立
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 菌株与载体
•     2.1.2 主要试剂
•     2.1.3 主要仪器和设备
•     2.1.4 主要溶液配制
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 筛选受体乳酸菌
•     2.2.2 egfp基因的克隆
•     2.2.3 pNZ8148-egfp重组质粒的构建
•     2.2.4 乳酸杆菌感受态的制备
•     2.2.5 构建重组乳酸杆菌
•     2.2.6 重组乳酸杆菌的诱导表达
•     2.2.7 重组乳酸杆菌生理特性及遗传稳定性检测
•   2.3 实验结果
•     2.3.1 筛选受体乳酸菌结果
•     2.3.2 PCR扩增egfp基因结果
•     2.3.3 重组克隆载体的鉴定结果
•     2.3.4 pNZ8148和pEASY-Blunt-Simple-egfp双酶切结果
•     2.3.5 重组表达载体的鉴定结果
•     2.3.6 重组乳酸杆菌的鉴定结果
•     2.3.7 重组乳酸杆菌诱导表达EGFP的 CLSM分析结果
•     2.3.8 重组乳酸杆菌诱导表达EGFP的 Western blot分析结果
•     2.3.9 重组乳酸杆菌生长曲线测定结果
•     2.3.10 重组乳酸杆菌在不同温度下的生长情况测定结果
•     2.3.11 重组乳酸杆菌在不同pH下的生长情况测定结果
•     2.3.12 重组乳酸杆菌在不同Na Cl含量下的生长情况测定结果
•     2.3.13 重组乳酸杆菌耐受人工胃液的测定结果
•     2.3.14 重组乳酸杆菌耐受含胆盐的人工肠液的测定结果
•     2.3.15 重组质粒遗传稳定性测定结果
•   2.4 讨论与分析
• 第三章 乳酸杆菌递送金葡菌抗原系统的建立
•   3.1 实验材料
•     3.1.1 菌株与载体
•     3.1.2 主要试剂
•     3.1.3 主要仪器及设备
•     3.1.4 主要溶液配制
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 抗原基因的设计及合成
•     3.2.2 pNZ8148-fhuD2、pNZ8148-hla H35L重组质粒的构建
•     3.2.3 构建重组乳酸杆菌
•     3.2.4 重组乳酸杆菌的诱导表达
•     3.2.5 重组乳酸杆菌生理特性及遗传稳定性检测
•   3.3 实验结果
•     3.3.1 pUC57-Simple-fhuD2和pUC57-Simple-hla H35L双酶切结果
•     3.3.2 重组表达载体的鉴定结果
•     3.3.3 重组乳酸杆菌的鉴定结果
•     3.3.4 重组乳酸杆菌诱导表达抗原的Western blot分析
•     3.3.5 重组乳酸杆菌生长曲线测定结果
•     3.3.6 重组乳酸杆菌在不同温度下的生长情况测定结果
•     3.3.7 重组乳酸杆菌在不同pH下的生长情况测定结果
•     3.3.8 重组乳酸杆菌在不同Na Cl含量下的生长情况测定结果
•     3.3.9 重组乳酸杆菌耐受人工胃液的测定结果
•     3.3.10 重组乳酸杆菌耐受含胆盐的人工肠液的测定结果
•     3.3.11 重组质粒遗传稳定性测定结果
•   3.4 讨论与分析
• 第四章 乳酸杆菌递送金葡菌抗原疫苗的效果评价
•   4.1 实验材料
•     4.1.1 菌株与载体
•     4.1.2 主要试剂
•     4.1.3 主要仪器及设备
•     4.1.4 主要溶液配制
•     4.1.5 实验动物
•   4.2 实验方法
•     4.2.1 小鼠分组及免疫
•     4.2.2 小鼠血清中特异性抗体IgG的测定
•     4.2.3 建立S.aureus肺部感染模型
•     4.2.4 小鼠存活率统计
•     4.2.5 各组小鼠肺部病理变化分析
•     4.2.6 小鼠肺部载菌量测定
•   4.3 实验结果
•     4.3.1 小鼠血清中特异性抗体IgG检测结果
•     4.3.2 小鼠肺部感染S.aureus后的存活率统计
•     4.3.3 小鼠肺部病理变化分析
•     4.3.4 小鼠肺部载菌量统计
•   4.4 讨论与分析
• 结论
• 展望
• 参考文献
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 潘娜

导师: 王潇

关键词: 乳酸杆菌,递送载体,金黄色葡萄球菌,疫苗

来源: 内蒙古大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 内蒙古大学

分类号: R392-33

总页数: 98

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