布鲁菌分子标记菌壳株的构建与鉴定

论文摘要

旨在构建一种安全、高效的犬布鲁菌分子标记疫苗株。本试验将温控裂解部件（TLC）插入布鲁菌自杀质粒pBK-CMV-SacB-ΔB0419中,构建温控裂解型自杀质粒pBK-CMV-SacB-ΔB0419-TLC;通过电转化方式转入犬布鲁菌RM6/66感受态中,经卡那抗性和蔗糖培养基的正、负向筛选,将TLC片段定点插入布鲁菌B0419基因中,获得犬布鲁菌分子标记菌壳株。采用PCR法对连续30代次的菌株进行鉴定,结果显示裂解E基因和靶向插入位点区域（B0419基因）并未出现丢失和回复突变现象,表明该菌壳株具有良好的遗传稳定性。该菌壳株在培养至D600值为0.6时,经42℃诱导60 h后,可获得裂解率达100%的犬布鲁菌菌壳;经超薄切片和染色处理后,在透射电镜观察下可见形态完整的空心结构,其内容物明显减少。本试验结合细菌菌壳技术与同源重组技术,成功构建了具有分子标记特征的犬布鲁菌菌壳株,为新型布鲁菌疫苗的研制提供策略。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1 菌株、质粒和实验动物
•   1.2 主要试剂
•   1.3 引物的设计与合成
•   1.4 重组质粒pBK-CMV-SacB-ΔB0419的构建与鉴定
•   1.5 温控裂解型自杀质粒pBK-CMV-SacB-ΔB0419-TLC的构建与鉴定
•   1.6 重组犬布鲁菌RM6/66-TLC株的构建和鉴定
•   1.7 重组犬布鲁菌RM6/66-TLC株的遗传稳定性检测
•   1.8 重组犬布鲁菌RM6/66-TLC株的生长及裂解曲线分析
•   1.9 犬布鲁菌菌壳的电镜观察
•   1.10 犬布鲁菌菌壳对小鼠的安全性试验
• 2 结果
•   2.1 B0419基因上游、下游同源臂与TLC片段的扩增
•   2.2 重组质粒pBK-CMV-SacB-ΔB0419-TLC的构建与鉴定
•   2.3 重组犬布鲁菌RM6/66-TLC株的鉴定
•   2.4 重组犬布鲁菌RM6/66-TLC株的遗传稳定性检测
•   2.5 重组犬布鲁菌RM6/66-TLC株的生长曲线与裂解率测定
•   2.6 犬布鲁菌菌壳的电镜观察
•   2.7 犬布鲁菌菌壳对小鼠的安全性评价
• 3 讨论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 卜昭阳,钱晶,梁佳茗,王莉,屈海龙,王晓旭,杨艳玲,王秀然,闫广谋,郎需龙,王兴龙

关键词: 犬布鲁菌,分子标记,细菌菌壳,同源重组,候选疫苗

来源: 中国兽医学报 2019年08期

年度: 2019

分类: 农业科技,基础科学

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 军事医学科学院军事兽医研究所,江苏省农业科学院兽医研究所,吉林农业大学动物科学技术学院,中国农业科学院特产研究所,吉林大学动物医学学院

基金: 国家重点研发计划基金资助项目(2016YFD0501000,2018YFD0500900),国家公益性行业(农业)科研专项基金资助项目(201303042),国家自然科学基金资助项目(31402183)

分类号: S852.61

DOI: 10.16303/j.cnki.1005-4545.2019.08.18

页码: 1533-1539

总页数: 7

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