紧密粘附素论文_罗云,易勇,毛旭虎,邹全明,肖敏

导读:本文包含了紧密粘附素论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:大肠杆菌,血性,紧密,受体,晶体,免疫,结构。

紧密粘附素论文文献综述

罗云,易勇,毛旭虎,邹全明,肖敏^[1]（2008）在《EHECO157:H7紧密粘附素胞外特异性片段(intiminC)的表达纯化及免疫检测的初步应用》一文中研究指出目的:克隆表达并纯化肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7紧密粘附素胞外特异性片段(intiminC),摸索其免疫检测的初步应用。方法:设计引物采用PCR法自EHEC O157:H7基因组扩增紧密粘附素胞外特异性片段的编码基因eaeC,T-A克隆后构建原核表达质粒pET-21a(+)-eaeC,经测序鉴定后转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达,PAGE检测。目的蛋白经包涵体洗涤,使用含谷胱甘肽氧化还原系统的复性缓冲液进行稀释并结合透析复性后,再用阴离子交换柱Resource Q和分子筛柱Superdex200进行纯化。将所得高纯度目的蛋白包被ELISA酶标板,对实验动物的免疫血清进行检测。结果:PCR法自EHEC O157:H7基因组扩增出了约570 bp的目的片段;原核表达质粒pET-21a(+)-eaeC经酶切及测序鉴定与设计序列一致。转化E.coliBL21(DE3)后IPTG诱导目的蛋白表达率约35%;PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量(Mr)约20×103,破菌后电泳证实目的蛋白均以包涵体形式表达。包涵体复性后目的蛋白纯化效果明显,高纯度的intiminC蛋白包被ELISA板,对实验室动物免疫血清的检测效果良好。结论:EHEC O157:H7紧密粘附素胞外特异性片段经基因克隆后获得了较好的表达,复性纯化后获得高纯度的目的蛋白intiminC,在此基础上建立的ELISA检测方法对实验室动物免疫血清的检测效果良好。为进一步的人血清抗体检测及EHEC O157:H7感染的流行病学研究奠定了基础。(本文来源于《中国卫生检验杂志》期刊2008年08期）

易勇^[2]（2007）在《EHEC O157：H7紧密粘附素胞外区的晶体结构及功能研究》一文中研究指出肠出血性大肠杆菌(EHEC) O157:H7是一种重要的新发传染病病原菌。自1975年被首次分离、1982年被确认为致病菌以来的20多年中,世界各地包括中国都有不同规模的暴发流行。EHEC O157:H7感染可使人患腹泻、出血性结肠炎(hemorrhagic colitis,HC),还可在5~10%的病例中引发溶血性尿毒综合征(hemolytic uremic syndrome,HUS)及血栓性血小板减少紫癜(thrombotic thrombocytopenic purpura,TTP)等严重并发症,严重者可导致死亡。EHEC O157的感染因具有暴发流行趋势、强烈的致病性与致死性和抗生素治疗可加剧病情的危险性等特点,已经成为全球性的公共卫生问题。病原微生物与宿主的相互作用是决定其感染、发病和预后的关键。粘附定植是O157致病前提。紧密粘附素(Intimin)是O157最主要的定植因子,尤其是它的C端1/3部分(Intimin-C)为胞外功能区,与相应受体(转位紧密粘附素受体,translocated intimin receptor,Tir)结合,介导细菌与肠上皮细胞的紧密粘附,是细菌的重要致病因子。Tir是O157细菌本身基因编码的受体蛋白质,通过其Ⅲ型分泌系统最终整合于宿主细胞膜上,行使紧密粘附素受体的功能。解析紧密粘附素(Intimin)的结构以及研究紧密粘附素(Intimin)与转位紧密粘附素受体Tir蛋白的相互作用特点有助深入认识EHEC O157:H7粘附定植的分子机制和致病机理。据此有可能发现更加高效特异的疫苗抗原表位和新的药物作用靶点。基于以上认识,本实验拟克隆表达紧密粘附素(Intimin)及转位紧密粘附素受体Tir蛋白的相互作用功能区,进行晶体培养结构解析与功能验证的相关研究。1.对O157:H7的IntiminC188及转位紧密粘附素受体Tir结合片段(Tir-M)进行基因克隆表达复性纯化,获得有活性高纯度的蛋白。设计引物采用PCR法自O157菌基因组扩增IntiminC188、Tir-M的编码基因eae-c188与tir-m,构建原核表达质粒pET-21a(+)-eaeC188和pET-21a(+)-tir-m,经测序鉴定后转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,PAGE电泳检测。目的蛋白IntiminC188经包涵体洗涤后复性,再用阴离子交换柱纯化;Tir-M经超声破菌后镍离子亲和纯化,再用阴离子交换柱纯化。结果显示PCR法自O157菌基因组分别扩增出了约600bp和280bp的目的片段;原核表达质粒pET-21a(+)-eaeC188和pET-21a(+)-tir-m经酶切及测序鉴定,所扩增的TirM基因序列与GenBank公布的序列完全一致,而eaeC188基因序列与GenBank的序列相比较有一个碱基的突变,导致表达的蛋白有一个关键氨基酸的突变(intiminN916Y)。更换高保真的pfu DNA polymerase重新扩增目的基因,再次构建克隆。重新构建的克隆经测序正确无误。转化E.coli BL21(DE3)后IPTG诱导目的蛋白表达,PAGE电泳初步测定目的蛋白的分子量与预期一致。破菌后电泳证实目的蛋白IntiminC188及突变体以包涵体形式表达,经包涵体洗涤、复性和阴离子交换柱纯化后目的蛋白纯度>95%;目的蛋白Tir-M以可溶蛋白形式表达,经镍离子亲和纯化与阴离子交换柱纯化后目的蛋白纯度>95%。适合进行蛋白晶体培养和功能研究。2.在获得高纯度intiminC188及突变体intiminN916Y蛋白的基础上,使用Hampton Research (Laguna Nigel, CA, USA)公司的晶体初筛试剂盒crystal screen Kit I和Kit II,气相扩散悬滴法进行初步的结晶条件筛选。对筛选获得质量较好的晶体进行X-线衍射收集衍射数据。分子置换法进行晶体结构解析,并对其结构进行初步分析。结果获得了质量较好的intiminC188及突变体intiminN916Y蛋白晶体和衍射数据,并解析了晶体结构。分析了intiminC188及突变体intiminN916Y蛋白晶体的细微差别,并对intiminC188的晶体结构与分子置换的模型EPEC的intiminC结构(PDB,编号1F00)进行结构重迭比对分析,其结构总体相似,但细节有一定差别。3.在对IntiminC188及突变体和转位紧密粘附素受体Tir的Intimin结合片段(Tir-M或Tir-IBD)进行克隆表达复性纯化的基础上,利用BIACore 3000系统对IntiminC188及突变体与Tir-IBD进行了亲和力与结合动力学的研究。通过比较紧密粘附素突变前后与受体结合的动力学特征改变,证实了916位氨基酸对于紧密粘附素与受体结合的特殊意义。结合紧密粘附素及其突变体的晶体结构分析,916位氨基酸由N变为Y后,紧密粘附素的结合力改变与其晶体结构变化相吻合,从结构和功能的角度能够相互印证。综上所述,本研究采用基因工程技术成功表达IntiminC188及突变体和转位紧密粘附素受体Tir的Intimin结合片段(Tir-M或Tir-IBD),纯化后通过晶体培养X-线衍射技术解析了IntiminC188及突变体的分子结构;利用BIACore 3000系统对IntiminC188及突变体与Tir-IBD进行了亲和力与结合动力学的研究。(本文来源于《第叁军医大学》期刊2007-05-01）

易勇,邹全明,程建平,毛旭虎,朱永红^[3]（2004）在《肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7紧密粘附素免疫保护性片段(Intimin-C)的克隆表达纯化及部分生物学活性研究》一文中研究指出克隆表达并纯化肠出血性大肠杆菌 (EHEC)O15 7∶H7紧密粘附素免疫保护性片段 (Intimin C) ,并对其部分生物学活性进行研究。设计引物采用PCR自O15 7菌基因组扩增紧密粘附素免疫保护性片段 (Intimin C)的编码基因eae C(本文来源于《微生物学杂志》期刊2004年05期）

紧密粘附素论文开题报告

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

肠出血性大肠杆菌(EHEC) O157:H7是一种重要的新发传染病病原菌。自1975年被首次分离、1982年被确认为致病菌以来的20多年中,世界各地包括中国都有不同规模的暴发流行。EHEC O157:H7感染可使人患腹泻、出血性结肠炎(hemorrhagic colitis,HC),还可在5~10%的病例中引发溶血性尿毒综合征(hemolytic uremic syndrome,HUS)及血栓性血小板减少紫癜(thrombotic thrombocytopenic purpura,TTP)等严重并发症,严重者可导致死亡。EHEC O157的感染因具有暴发流行趋势、强烈的致病性与致死性和抗生素治疗可加剧病情的危险性等特点,已经成为全球性的公共卫生问题。病原微生物与宿主的相互作用是决定其感染、发病和预后的关键。粘附定植是O157致病前提。紧密粘附素(Intimin)是O157最主要的定植因子,尤其是它的C端1/3部分(Intimin-C)为胞外功能区,与相应受体(转位紧密粘附素受体,translocated intimin receptor,Tir)结合,介导细菌与肠上皮细胞的紧密粘附,是细菌的重要致病因子。Tir是O157细菌本身基因编码的受体蛋白质,通过其Ⅲ型分泌系统最终整合于宿主细胞膜上,行使紧密粘附素受体的功能。解析紧密粘附素(Intimin)的结构以及研究紧密粘附素(Intimin)与转位紧密粘附素受体Tir蛋白的相互作用特点有助深入认识EHEC O157:H7粘附定植的分子机制和致病机理。据此有可能发现更加高效特异的疫苗抗原表位和新的药物作用靶点。基于以上认识,本实验拟克隆表达紧密粘附素(Intimin)及转位紧密粘附素受体Tir蛋白的相互作用功能区,进行晶体培养结构解析与功能验证的相关研究。1.对O157:H7的IntiminC188及转位紧密粘附素受体Tir结合片段(Tir-M)进行基因克隆表达复性纯化,获得有活性高纯度的蛋白。设计引物采用PCR法自O157菌基因组扩增IntiminC188、Tir-M的编码基因eae-c188与tir-m,构建原核表达质粒pET-21a(+)-eaeC188和pET-21a(+)-tir-m,经测序鉴定后转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,PAGE电泳检测。目的蛋白IntiminC188经包涵体洗涤后复性,再用阴离子交换柱纯化;Tir-M经超声破菌后镍离子亲和纯化,再用阴离子交换柱纯化。结果显示PCR法自O157菌基因组分别扩增出了约600bp和280bp的目的片段;原核表达质粒pET-21a(+)-eaeC188和pET-21a(+)-tir-m经酶切及测序鉴定,所扩增的TirM基因序列与GenBank公布的序列完全一致,而eaeC188基因序列与GenBank的序列相比较有一个碱基的突变,导致表达的蛋白有一个关键氨基酸的突变(intiminN916Y)。更换高保真的pfu DNA polymerase重新扩增目的基因,再次构建克隆。重新构建的克隆经测序正确无误。转化E.coli BL21(DE3)后IPTG诱导目的蛋白表达,PAGE电泳初步测定目的蛋白的分子量与预期一致。破菌后电泳证实目的蛋白IntiminC188及突变体以包涵体形式表达,经包涵体洗涤、复性和阴离子交换柱纯化后目的蛋白纯度>95%;目的蛋白Tir-M以可溶蛋白形式表达,经镍离子亲和纯化与阴离子交换柱纯化后目的蛋白纯度>95%。适合进行蛋白晶体培养和功能研究。2.在获得高纯度intiminC188及突变体intiminN916Y蛋白的基础上,使用Hampton Research (Laguna Nigel, CA, USA)公司的晶体初筛试剂盒crystal screen Kit I和Kit II,气相扩散悬滴法进行初步的结晶条件筛选。对筛选获得质量较好的晶体进行X-线衍射收集衍射数据。分子置换法进行晶体结构解析,并对其结构进行初步分析。结果获得了质量较好的intiminC188及突变体intiminN916Y蛋白晶体和衍射数据,并解析了晶体结构。分析了intiminC188及突变体intiminN916Y蛋白晶体的细微差别,并对intiminC188的晶体结构与分子置换的模型EPEC的intiminC结构(PDB,编号1F00)进行结构重迭比对分析,其结构总体相似,但细节有一定差别。3.在对IntiminC188及突变体和转位紧密粘附素受体Tir的Intimin结合片段(Tir-M或Tir-IBD)进行克隆表达复性纯化的基础上,利用BIACore 3000系统对IntiminC188及突变体与Tir-IBD进行了亲和力与结合动力学的研究。通过比较紧密粘附素突变前后与受体结合的动力学特征改变,证实了916位氨基酸对于紧密粘附素与受体结合的特殊意义。结合紧密粘附素及其突变体的晶体结构分析,916位氨基酸由N变为Y后,紧密粘附素的结合力改变与其晶体结构变化相吻合,从结构和功能的角度能够相互印证。综上所述,本研究采用基因工程技术成功表达IntiminC188及突变体和转位紧密粘附素受体Tir的Intimin结合片段(Tir-M或Tir-IBD),纯化后通过晶体培养X-线衍射技术解析了IntiminC188及突变体的分子结构;利用BIACore 3000系统对IntiminC188及突变体与Tir-IBD进行了亲和力与结合动力学的研究。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。